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1、武夷菌素发酵条件的优化及效价的测定植物病理专业硕士研究生王立东指导教师谭万忠教授张克诚副研究员摘要武夷菌素是从不吸水链霉菌武夷变种( , S 坳t o m y c e sa h y g r o s c o p c u s v a t 肌y i 删圆哟发酵产物中提取研制出的一种具有广谱抗苗作用的农用抗生素。对多种作物病原真菌有较强抑制作用为了提高链霉菌产生武夷菌素的效价，本研究对不吸水链霉菌的培养条件和发酵培养基进行优化，并建立了高效液相色谱法测定发酵液中武夷菌素含量的技术1 对不吸水链霉菌产生武夷菌素原有的最佳发酵条件进行了验证和改进：发酵起始p H值为8 0 ，温度为2 5 2 8 “ C
2、，使用菌种的种龄为1 8 2 4 h ，这与之前采用的发酵条件相近发酵时问由原来的4 8 h 延长到6 4 h 采用原有的培养基配方进行检验，使用原来条件和优化后条件发酵，武夷菌素的效价分别为3 5 1 5 彤g m I 和4 4 4 3 L g m L , 可以提高2 6 4 z 首先应用替代法筛选出淀粉、葡萄塘、玉米粉、豆饼粉、化合物A 、B 和C 、M g S 0 4 、F e S 0 4 、N a C I 为武夷菌素发酵较适宜的碳、氮源和微量元素然后应用部分因子设计法对以上加种营养成份进行了分析，确定葡萄糖和豆饼粉为影响武夷菌素效价的关键因子，最后通过最陡爬坡实验逼进最大响应区域，用中
3、心组合设计法优化葡萄塘( x 婀豆饼粉( x ) 的浓度。得到武夷菌素效价( y ) 的二次多项式优化拟合模型其为：Y = 6 6 4 3 7 8 + 6 8 7 4 2 x2 +2 7 5 1 3 x , - 8 2 4 6 9 x ，一1 2 2 4 5 x2 ，4 - 6 2 0 9 4 x g 僻= 0 8 9 9 9 ，P 发生作用( 吸附、分配、离子吸引、捧阻、亲和)的大小、强弱不同导致其在固定相中滞留时间不同。从而先后从固定相中流出，又称为色层法、层析法色谱法最早是由俄国植物学家茨维特a h 妣1 9 0 6 年研究用碳酸钙分离植物色素时创立的，色谱法( c h I I 湖砷删y
4、 ) 因此得名最初仅仅是作为一种分离手段，直到五十年代人们才开始把这种分离手段与检测系统连系起来成为一种独特的分析方法后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时闻长( 常有几个小时) 高效液相色谱法O I i g 血p e “ O m L m j l u i da 啪衄嘲髀h y 瑚? 的是在经典液相色谱法的基础上，于本世纪年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相
5、色谱法但i g hX P 】r e s s u z eL i q u i dC 】u o m m t o g m p h y , 珊L D 又因分析速度快而称为高速液相色谱法删g hs p 。酣U q l l i dQ 脚螂弹p h 弘H S L P ) 也称现代液相色谱高效液相色谱佃H D 法应用s 高效液相色谱由于它具有高效、快速、适应面广等特点，因此近几年来，高效液相色谱在分析领域得到迅速的发展目前高效液相色谱的应用集中在生物化学、天然药物、合成药物、临床药物代谢等领域内高效液相色谱分析每年发表的论文很多，涉及到领域和刊物也很多，药物分析杂志 H P L C 的论文大约在卸左右( 师治贤
6、等，2 0 0 3 ) 。随着各项选择参数的深入研究，新的固定相的研制以及各种新分离模式出现将会使H P L C 的应用得到新的进展，其解决复杂分离技术问题的能力日见增强，应用领域更加广泛而深入表1 2 我国药典收藏高效液相色谱法项目和数量比较衰T a b l e l 2 T h e c o m p a r a t i v e t a b l e o f p r o j e c t a n d D B m b e g o fC h i n e s ep h a m m c o p o e i a c o l l e c t i o n数量 矗法瑷H19 e 5 年版t0 0 0 年版I 5 年
7、版2 0 0 0 年版鉴掰3 I5 dH P L C 法检青120I6 0含量测定76 0l lr3 0 ，9西南大学硕士学位论文第一章文献综述1 4 武夷菌素研究现状武夷菌素又称B o - 1 0 是中国农业科学院植物保护研究所生物农药与分子设计组从不吸水链霉菌武夷变种 a h y g r o s c o p c u sv 缸衄s i s ) 发酵液产物中发现的一种广谱、高效、低毒的农用抗生素( 韦日清，1 9 9 4 ；曾洪梅，2 0 0 3 ) 其主要成份为具有艟苷骨架的核苷类抗生素，具有我国自主的知识产权，有关该抗生素的结构及制备方法已申请中国发明专利。一0 1 H _ o 0 1 H
8、 - O c 占o H6 o H几年来，对武夷菌素进行了初步的研究。进行了以下工作并得出相应结论1 ) 菌种分类与鉴定；武夷菌素产生茜为不吸水链霉菌武夷变种僻a h y g r o s e o p a sv l rw u y 蛐X 韦日清等，1 9 9 4 ) 。2 ) 作用机理及有效成份的鉴定：武夷菌素是以碱性组分为主的多组分水溶性抗生素，根据紫外，红外、质谱，核磁共振等结果确定其主要活性组分为核苷类抗生素武夷菌素能引起菌丝畸形生长，造成菌丝原生质体渗漏，抑制菌丝蛋白质合成，引起分生孢子芽管膨大溢缩并通过激活植物体内防御系统诱导植株体内相关酶活性增加，提高作物抗病性( 孙延忠等，2 0 0
9、3 孙延忠等，2 0 0 4 ) 。3 ) 发酵和生产工艺的研究：对不同碳源、氨源、微量元素的利用及发酵条件进行了实验，初步确定了摇瓶发酵的适宜培养基和培养条件，并已经工厂化生产4 ) 推广应用，武夷菌素对小麦白粉病、油菜菌核病、黄瓜白粉瘸，番茄叶霉和灰霉病、柑橘疮痂病，茄子黄萎病、棉花立枯病、西瓜、黄瓜枯萎病有较好的防治效果，至2 0 0 0 年止，全国应用武夷菌素面积已达5 0 0 多万亩，经济效益和社会效益达2 5 3 0 亿元( 曾洪梅，2 0 0 3 ) 西南大学硕士学位论文第二章引言I I II 墨| 一 第二章引言武夷菌素又称B o - 1 0 是中国农业科学院植物保护研究所生物
10、农药与分子设计组从不吸水链霉菌武夷变种假m r y g r o s c o p 赴- u s 垤Lw u y i e n s i s ) 发酵液P ：物中发现的一种广谱、高效、低毒的农用抗生素，对多种作物的真菌病害效果明显，可有效防治瓜类白粉病、番茄灰霉病、叶霉病、黄瓜黑星病、棉花立枯病、芦笋茎枯病、大豆灰斑病等多种作物真菌病害，同时对作物生长还有一定的促进作用( 杨洪文等，2 0 0 2 ；马汇泉等，2 0 0 2 ；冉隆殉等，2 0 0 5 ) 在本研究前，通过诱变育种使得武夷菌素的效价从2 0 0 q u g m L 提高到4 0 蛳g m L , 但由于菌种的退化，目前武夷菌素的效价只
11、有3 5 0 0 ”g m 1 , 左右由于长年的诱变育种，可能使菌株发生变异从而导致武夷菌素最佳发酵条件发生变化，因此需要对武夷菌素发酵条件进行再次研究。摇瓶发酵培养基的研究采用的是单次单因子法，仅对单个因子( 碳潦、氮源、徽量元素)对发酵的影响作了初步研究，没有研究因子间的相互作用在此条件下确定的发酵培养基，只能使效价达到一定水平，不一定是最佳的发酵培养基因此采用新的发酵培养基研究方法提高武夷菌素单位效价成为一项比较紧迫的任务为了优化武夷菌素发酵与分离工艺，提高单位发酵液的产率和分离提取后各组分的收率等，必须建立准确、快速的定量分析方法。抗生素的效价测定方法主要有管臻法和高效液相色谱法0
12、U X O 目前武夷菌素效价测定是以深红酵母( R 幻而鼬r l l 6 忸) 为指示菌的管礤法。以该指示菌测定时抑制圈边界模糊不清，使得测定结果准确度不高，因此需要对此方法进行改进另外，管碟法只能测定发酵液中目标产物以及其他具有抗菌活性结构类似物的总效价，无法对各个组分进行精确的分析；I 璎I C 法不仅能克服以上缺点，而且具有检测灵敏度高、分析快速等优点本文首先对武夷菌素培养条件进行了优化，然后应用部分因子设计法、最陡爬坡法、中心组合设计法与J h 但软件相结合优化了武夷菌素发酵培养基建立武夷菌素发酵液中主要成份的I I P L C 定量分析技术和改进了管礤法测定武夷菌素效价的技术。同时建
13、立了两种检测技术测定武夷菌素效价之问的多元线性模型，使其在今后研究和生产中广泛应用1 1硬南大学硕士学位论文第三章武夷菌素产生菌培养条件的优化第三章武夷菌素产生菌培养条件的优化本项研究主要对不吸水链霉菌产生武夷菌素原有的最佳发酵条件进行了验证和改进，测定温度、p H 、种龄和发酵时间等培养条件对武夷菌素产量的影响，找到武夷菌素发酵的最佳条件。3 1 材料与方法3 1 1 材料与仪器1 ) 供试菌株t 生产菌为不吸水链霉菌武夷变种 4 细I 脚c 叩i c I 口v 札w u y i e m i s ) 经诱变后 褥到的高产菌株S - 4 0 | 以枯草芽孢杆菌溅s u b 幽) 为指示菌测定武
14、夷菌素的效价。两个菌株均由中国农业科学院植物保护研究所生物农药与分子设计组提供2 ) 实验仪器：游标卡尺( o 0 2n u n ) ，不锈钢牛津杯( 内径6 0 + 0 1i r m a ，外径7 8 “ 4 - 0 1m m ，高1 0 0 - 4 - 0 1n u n ) ，超净工作台( 哈东联) ，冰箱S t - 3 6 8 ( C a o m i a ) ，电子天平E S - 1 0 S ( 长沙) ，高压蒸汽灭菌锅上海) ，移液器( 大龙) 3 ) 培养基l 本工作所有培养基及溶液均经1 2 1 “ C 高压湿热灭菌2 0 r a i n 酵母青葡萄糖培养基：酵母膏1 0 9 、葡
15、萄塘l o g 、琼脂粉1 5 9 加蒸馏水至1 0 0 0 m L 马铃薯葡萄糖培养基( P D A 培养基) 去皮马铃薯2 0 0 9 、葡萄糖2 0 9 、琼脂粉7 9 加蒸馏水至1 0 0 0 m L o种子培养基与发酵培养基均为：玉米粉3 0 9 、豆饼粉2 0 9 、葡萄糖1 5 9 、淀粉t o g 、氯化铵3 o g 、碳酸钙3 O g 加自来水至1 0 0 0 m L 3 1 2 武夷菌素效价与培养温度及培养时间试验将武夷菌素产生菌的孢子转接到茄形瓶中的酵母膏葡萄塘培养基上，2 8 “ C 恒温培养5 7 d ，切成1 0 c m 2 大小的菌块接种到种子培养基上，在2 8 “ C 、1 8 0 q 锄条件下培养2 4 1 1 然后以3 的接种量接种到发酵培养基上，分别在2 5 1 2 、2 8 “ 0 、3 1 “ C U1 8 0 r p m 条件下分别培养7 4 h 、3 2 h 、4 0 h 、4 8 h ，5 6 h 、6 4 h 、7 2 h 后测定效价，每个梯度设3 个重复，结果见图3 1 3 1 3 酸碱度与武夷菌素效价之间的关系将武夷菌素产生菌的孢子转接到茄形瓶中的酵母膏葡萄糖培养基上，2 8 “ ( 2 恒温培养5 西南大学硕士学位论文第三章武夷菌素产生菌培养条件的优化7 d ，切成l 1 2 大小的菌块，接种到种子培养基上，在2
