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1、分类号： 密级： U D C ： 编号： 学 位 论 文 食物过敏患儿特异性抗体及细胞免疫因子变化特点及 其氨基酸乳品联合益生菌干预效应研究 Characteristics of specific antibodies and cell immune factors change in children with food allergies 6 month to 1 year old: 1.0 bid; more than one year of age: 1.0 tid) treatment for 6 months, two groups of children before and a
2、fter treatment was detected in the lymphocyte subsets. Observe changes against the immune indexes before and after treatment, the results are statistically analyzed. Results 1. The single and multiple groups of CD3+CD8+and CD3+CD4+/CD3+CD8+ lymphocytes subsets percentage were significantly lower tha
3、n the negative group (P 0.05). Conclusions FA patients immune indexes change internal body part, FA children have different changes in specific humoral and cell immune factors, the application of the amino acid formula can improve immunity in children with FA, plus probiotic treatment did not have a
4、dditive or synergistic effects. Key words: food allergies; specific antibodie IgE; CD23 安徽医科大学硕士学位论文 7 食物过敏患儿特异性抗体及细胞免疫因子变化特点及食物过敏患儿特异性抗体及细胞免疫因子变化特点及 其氨基酸乳品联合益生菌干预效应研究其氨基酸乳品联合益生菌干预效应研究 1 1 引言引言 食物过敏(Food Allergy, FA)是机体对一种或多种食物蛋白抗原产生的由免疫介导的不良反应1。按介导途径不同分为 IgE 介导的和(或)非 IgE 介导的变态反应。FA 多见于小年龄儿童，可以引起多器官
5、受累，最常见的是消化系统、皮肤黏膜和呼吸系统。其中消化系统症状可表现为腹痛、腹泻、腹胀、便秘、消化道出血、恶心、呕吐、拒奶、溢乳、喂养困难、肛瘘等，上述症状若迁延不愈将造成生长发育受限、缺铁性贫血、低蛋白血症、水肿等并发症。FA 的消化道症状和并发症均为非特异性，且以非 IgE 介导为主，极易误诊。牛奶、蛋、花生、坚果、鱼、贝类、大豆和小麦等 8 种是主要的致敏食物2。所以本课题选择研究对象为存在消化道症状或伴有皮肤黏膜、呼吸系统症状，临床疑似为 FA 的患儿。 随着食品工业的发展， 儿童 FA 的患者日益增多， 据统计， 全世界约有 5 8 的儿童患有 FA3,已严重影响到儿童的生长发育，
6、也给家庭和社会造成极大的负担。尤其是慢性腹泻的患儿，被误诊和滥用抗生素的情况依然存在，寻找有效的、安全的 FA 防治措施迫在眉睫。 食物过敏性疾病至今发生的原因仍不完全清楚，可能与婴儿口服耐受形成延迟或破坏有关。德国科学家 Fooker 博士认为食物在进入消化道后，被消化至氨基酸、甘油和单糖水平，这样才能完全转化为能量提供人体所需。但许多食物，因为缺乏相应的酶而无法被人体完全消化，以多肽或其他分子形式进入肠道，被机体视为异物，从而导致免疫反应的发生，产生食物特异性 IgG 抗体。IgG 抗体与食物分子结合形成免疫复合物(型变态反应)，可引起所有组织(包括血管)发生炎症反应，并表现为全身各系统的
7、症状与疾病，所以如果不能及时改变饮食结构，引起过敏的食物会继续形成免疫复合物，会加重原有的症状。 安徽医科大学硕士学位论文 8 食物过敏反应中的关键细胞为树突状细胞(dendritic cell， DC)和 Th2 细胞。DC 捕获和加工外源性抗原，并递呈抗原信息给 T 淋巴细胞4，激活 T 淋巴细胞介导的免疫反应，不成熟的 DC 刺激初始 T 淋巴细胞增殖、分化的能力弱，成熟的DC 高表达 MHC-/类分子，与刺激分子如 CD80 和 CD86 等协助抗原信息递呈过程， 有效活化 T 淋巴细胞5。 初始 CD4+ T 淋巴细胞被激活后分化为 Th1、 Th2 或 Treg细胞， Th1细胞释
8、放1型细胞因子如IFN-； Th2细胞主要释放IL-4、 IL-5和IL-13。而 IL-4 和 IL-3 可诱导 B 淋巴细胞产生抗原特异性 IgE，产生一系列致敏反应，再暴露于特异性抗原后，IgE 激活肥大细胞释放致敏物质促发超敏反应和产生过敏临床症状。FA 者除了体内特异性 IgE 水平显著升高以外，还存在 Th1/Th2 型免疫反应失衡，Th2 型反应过强而 Th1 型反应受抑制6。 近年来， 与 FA 相关的各个领域都做了大量的研究。 希望通过特异性的抗体检测明确 FA 的病因，以及免疫性指标的检测来指导 FA 的治疗和预防。众多文献指出血清食物过敏原特异性 IgG 的检测对过敏性疾
9、病的病因诊断具有重要的指导意义7。 黄钰君等8通过对广州地区食物过敏儿童血清总 IgE 水平、 外周血 CD19+ B淋巴细胞水平的研究，认为体液免疫功能指标的检测在儿童食物过敏诊断和治疗中的应用值得进一步研究。 正是由于 FA 存在免疫失衡， 国内外做了很多的努力设法通过实验研究去纠正免疫失衡，达到治疗食物过敏的目的。通过应用免疫调节多糖，-葡聚糖影响免疫细胞，如单核细胞，NK 细胞和树突状细胞，来改善Th1/Th2 的失衡9。另外，唐文静等通过研究益生菌干预对卵清蛋白(OVA)诱导幼鼠食物过敏发生的影响，得出益生菌干预能够通过调节模型动物 Th1/Th2 细胞因子的平衡起到防治 FA 的作
10、用10。 还有通过过敏性疾病患者的 I 期临床试验， 证明靶向CD23的单克隆抗体可使受试者血清总 IgE水平降低75,可作为过敏性疾病的治疗方法11。在上述研究的基础上，本课题在选用免疫学指标的检测方面，力争有特异性和代表性。 目前对于 FA 的诊断标准是通过详细询问患者的病史和家族史，全面的体检，同时结合相关实验检查进一步确证，传统的检测方法主要包括以下三项：皮肤点安徽医科大学硕士学位论文 9 刺试验、食物特异性 IgE 浓度测定、口服激发试验12。皮肤点刺试验仍是 FA 诊断的基本步骤，血清特异性 IgE 抗体检测是 FA 诊断程序中的核心环节。 严格的食物回避和逐渐提高过敏食物剂量来获
11、得口服耐受性是目前最常用的治疗方法。多项临床多中心的研究证实，使用适度水解蛋白配方奶粉对婴儿期牛奶蛋白过敏具有预防和治疗作用，包括临床过敏症状发生率的降低、血清中牛奶特异性 IgE 水平的降低等13。 目前食物过敏原的特异性免疫治疗仍在实验研究阶段:皮下注射花生抗原进行特异性免疫治疗,逐渐提高过敏食物剂量来获得口服耐受性具 有可行 性， 少量进 食过敏 食物 可能诱 导耐受 ， 口 服脱敏 (oral immuno-therapy，OIT)的有效性尚未被证明14。所以本课题选用较为常用的食物回避治疗、游离氨基酸喂养治疗以及安全的益生菌治疗为治疗方法。 鉴于上述机制以及研究背景，我们从以下几个方
12、面进行研究：1）通过检测以消化道症状为主要表现的 FA 患儿， 分析单一过敏组和多种过敏组患儿与阴性者的免疫学指标的不同；2）通过检测 FA 患儿的过敏原特异性抗体以及免疫学指标，分析不同的过敏原特异性抗体其免疫学指标变化不同；3）通过对 FA 患儿的临床干预， 分析免疫学指标的变化情况， 进一步研究和探讨 FA 患儿的免疫学机制和临床治疗干预方面的意义。 2 2 材料与方法材料与方法 2.12.1 研究对象：研究对象： 2.1.12.1.1对象的收集对象的收集 选择安徽医科大学儿科临床学院消化内科2012年10月至2012年 12 月因有消化道症状或伴有皮肤黏膜、呼吸系统症状，临床疑似为 F
13、A 的住院患儿共 50 例。 2.1.2 2.1.2 选择标准选择标准 在详细询问病史的基础上，进行食物过敏原特异性 IgE 抗体浓度、食物过敏原特异性 IgG 抗体浓度、淋巴细胞亚群和 CD23 检测测，检测出疑似过敏原（如牛奶、蛋类等） ，通过开放性食物激发试验，可疑食物诱发症状，归避疑似过敏原症状好转甚至消失, 诊断该患儿 FA15，分为阳性组和阴性组，并计算安徽医科大学硕士学位论文 10 男女比例、中位年龄。所有患者在检测前均未用或停用抗组胺药 1 周以上。 2.2 2.2 试剂和仪器试剂和仪器 2.2.12.2.1 主要试剂和来源主要试剂和来源 （1）总免疫球蛋白总免疫球蛋白 E 测
14、定试剂盒测定试剂盒 规格规格 250 个测试孔个测试孔/盒盒 生产商：贝克曼库尔特有限公司生产商：贝克曼库尔特有限公司 主要组成成分主要组成成分 成成 分分 R1a 包被有羊抗大鼠IgG:大鼠抗IgE单抗复合物的磁性颗粒的TRIS缓冲液、离子表面活性剂、小牛血清白蛋白(BSA)、蛋白（羊源性)，0.1的叠氮钠、0.1ProClin300； R1b 含有猪抗 IgE-碱性磷酸酶（小牛源性)酶结合物的 Tris 缓冲液、小牛血清白蛋白（BSA)、蛋白（猪源性)、离子表面活性剂、0.1的叠氮钠、0.1ProClin 300。 （2）食物特异性）食物特异性 IgG 抗体检测试剂盒（酶联免疫法）规格：抗
15、体检测试剂盒（酶联免疫法）规格：3 96t 人份人份/盒盒 生产商：北京海瑞祥天生物科技有限公司生产商：北京海瑞祥天生物科技有限公司 批号：批号：130102 主要组成成分主要组成成分 包被食物抗原的微孔板 14 种食物过敏原的微孔板 3 96 孔 样本稀释液 载体蛋白溶于 0.01M 磷酸盐缓冲液中 1 56ml 标准血清 原料来源于人类血清，用于绘制标准曲线 1 1.0ml 阳性对照 原料来源于人类血清，用于确保有效 1 1.0ml 浓缩清洗液（3：200） 2.5%曲拉通溶于磷酸盐缓冲液中 1 30ml 酶标抗体结合液 辣根过氧化物酶标记的马抗人 IgG 抗体和载体蛋白溶于 0.01M
16、磷酸盐缓冲液中 1 33ml 底物液“A“ （3，3，5，5四甲基联苯胺 TMB 溶于二甲基亚砜缓冲液中） 2 12ml 底物液“B“ 过氧化氢溶于醋酸盐缓冲液中 2 12ml 终止液 0.5M 硫酸 1 20ml 安徽医科大学硕士学位论文 11 （3）过敏原特异）过敏原特异性抗体性抗体 IgE 检测试剂盒（酶联免疫法）规格：检测试剂盒（酶联免疫法）规格：96tests/盒盒 生产商：杭州浙大迪迅生物基因工程有限公司生产商：杭州浙大迪迅生物基因工程有限公司 批号：批号：131028 主要组成成分主要组成成分 可拆酶标板 含总 IgE、牛奶、鸡蛋白、牛肉、羊肉、鳕鱼、虾、蟹、腰果、芒果 96wells 96wells 5块 HRP 酶联二抗 A 液 (含蛋白稳定剂的辣根过氧化物酶标记的抗人 IgE 抗体溶液） 0.6ml 1 瓶 3ml 1 瓶 酶联二抗 B 液(绿色)含
