利用biacorea100对杂交瘤的早期动力学筛选可实现充满信

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1、GE Healthcare 应用指南84 Biacore 系统 利用Biacore A100对杂交瘤的早 期动力学筛选可实现充满信心的 抗体选择 直接从杂交瘤样品中进行单克隆抗体（mAb）的快速动力学筛选 800 个杂交瘤/天的高效筛选速率 高效的单克隆抗体筛选，有着理想的动力学特征 选定单克隆抗体的高分辨率动力学鉴定 直接在粗制样品中测定的亲和力和动力学参数 专门的评估软件在数分钟内处理动力学数据 候选物的选择基于与治疗相关的结合特性 在不同缓冲液条件下的平行分析， 以鉴定抗体性能的稳定性 与 ELISA 等终点分析相比， 可在工艺开发早期更充满信心地选择单克隆抗体 “Biacore A10

2、0 可在准确测定结合动力学和亲和力上实现大幅度的通量增加，以协助在开发过程中更早作出导向选择。” Scott L. Klakamp 博士，美国 Abgenix 公司的资深科学家 致谢 我们很感谢 Scott Klakamp & Andy Drake（Abgenix 公司）及 David Myszka（犹他州大学）的宝贵贡献，让此次合作变得可行。 图 1. Biacore A100 在一个多功能、 高性能的系统中， 为直接来自粗制杂交瘤样品的单克隆抗体提供了快速的动力学筛选和高分辨率的动力学鉴定。 简介 单克隆抗体（mAb）代表了一类重要的蛋白，它们对整个生物医学领域产生了深刻的影响。它们可作为

3、了解疾病过程中必不可少的研究工具，或作为精确诊断试剂，并且越来越多地作为多种疾病的生物治疗药物。如今，技术的进步实现了针对特定生物体目标的大量抗体的生产，使筛选方法成为日益增长的需求，这些方法能为自信的候选物筛选提供所需的高质量结合数据。 与 ELISA 等标准的需要标记的终点筛选方法相比，无标记相互作用分析的 Biacore 系统可实现抗体性能的分析， 促进了基于功能上相关的动力学性质的筛选。 通过”Epitope Focused Selection”技术 产生改造的人 Fab适当的分析形式能够直接在粗提的杂交瘤样品中进行快速的分析，而抗原消耗量相对较低，大约是一般 ELISA的 50%。B

4、iacore A100 每天能够进行大约 800 个杂交瘤样品的动力学筛选，其中每个循环中可同时分析 8 个单克隆抗体。那些显示出理想的结合特征的精选样品随后根据定量亲和力和动力学速率常数数据开展全面的动力学鉴定。 这个信息是基于单克隆抗体-抗原相互作用的彻底了解，有利于充满信心地选择候选单克隆抗体。平行处理能够同时分析多达四种不同的缓冲液环境（比如盐浓度和 pH） 下的相互作用。 这种类型的数据也许能够为治疗型抗体提供了宝贵的附加选择参数，因为治疗型抗体必须在患者体内复杂且可能变化的生物化学环境中发挥作用。 研究目的 总共 384 个粗制杂交瘤样品（包括多个阴性对照）是由Abgenix 公司

5、提供的。初期的策略是开展所有样品的快速动力学筛选，利用单一浓度的目标抗原（身份保密） ，筛选出一系列有着良好结合特征的单克隆抗体子集。然后利用一系列浓度的抗原来对选出的单克隆抗体进行分析，以及进行全面的鉴定以确定动力学速率常数。这次合作研究的目标如下： 评估 Biacore A100 以所需的通量速率（ 800 个/天）对Abgenix 杂交瘤样品的快速动力学筛选 评估以所需的动力学特征筛选单克隆抗体时快速动力学筛选的数据质量 获得精选单克隆抗体的高分辨率、定量的动力学和亲和力数据 探索在多个生物化学环境下平行分析单克隆抗体性能的可能性 利用XenoMouse 技术生产人单克隆抗体 本研究所用

6、的抗体是来自 Abgenix 公司，他们利用XenoMouse 技术实现了完全人源化的 IgGk 和 IgG1 抗体在小鼠中的生产，这些抗体是转基因的，带有人 IgG 位点。 “人源化”抗体的传统方法是将小鼠单克隆抗体的互补决定区 （CDR） 移植到人 IgG 框架中， 而这些来自 Abgenix的抗体则不同，它们在序列上是 100%属于人的。这大大降低了患者体内不想要的免疫反应的风险，显著提高了单克隆抗体作为成功治疗剂的可能性。 结果 384 个杂交瘤的快速动力学筛选 如图 2 所示， 来自两个杂交瘤样品的单克隆抗体在每个独立、平行的流动槽（共四个）中被山羊抗人 IgG 抗体捕获。单一浓度的

7、抗原同时注入这 8 个单克隆抗体中。在记录下相互作用之后，去除结合的抗原和捕获的抗体，再生传感器表面，为下一个循环做准备。通过这种方法，在一个 8 小时的运行内分析了 256 个杂交瘤，满足了所需的800 个/24 小时的通量速率。每次运行（= 256 个单克隆抗体）的抗原消耗为 3.5 纳摩尔的数量级，比典型的 ELISA 节省了约 50%。 图 2. 快速动力学筛选的分析设置。捕获抗体（山羊抗人 IgG）固定在每个流动槽的 4 个检测点上，为每种捕获的单克隆抗体提供了邻近参考。 利用报告点数值评估筛选结果 无标记的相互作用分析产生了结合和解离全过程的结合反应相对时间的实时图像 （传感图）

8、。 具体选定时间的结合反应 （数据点）可记录，以便快速绘制出感兴趣的结合性质（详见本指南末尾的监控相互作用） 。 图 3 显示了筛选分析所记录的每个 mAb-抗原相互作用的结合晚期 （binding_late report point）和解离晚期（stability_late report point）的反应图。由于binding_late 反 应 与 相 互 作 用 的 结 合 速 率 相 关 ， 而stability_late 反过来与解离速率相关， 这两种数值为每个单克隆抗体的动力学特征提供了很好的概览。 图 3. 杂交瘤的快速动力学筛选， 由数据点图评估 （反应标准化到捕获水平） 。图

9、中标出了相当于低/无结合物和最高亲和力的区域，以及挑选出用于下一步鉴定的 16 个单克隆抗体。 如图 3 所示，来自 384 个杂交瘤样品的单克隆抗体表现出多种动力学特征。 Abgenix 还匿名提供了多个阴性杂交瘤， 所有这些都是通过动力学筛选分析的无结合物确定的（即未检测到已知的假阳性） 。利用这个特征，挑选出 16 个杂交瘤，用于全面的动力学鉴定， 覆盖阳性样品的广泛结合和解离性质。 来自快速动力学筛选的亲和力&动力学参数估计 单个结合曲线可用于推导Ka和Kd的近似值以及亲和力估计值，但是完全定量的高分辨率动力学鉴定需要来自一系列分析物浓度的多个传感图的分析。为了获得对应于报告点图中所观

10、察到的图像的亲和力/动力学参数范围估计值，将传感图拟合成 1:1 的相互作用模型，并用速率常数近似值生成解离/结合速率图（图 4） 。与数据点图标出的那些相比（图 3） ，从这个Kd估计值相对Ka估计值的对数图中，我们观察到动力学特征的大致良好关联。解离/结合速率图还表明许多单克隆抗体位于 1-10 nM的亲和力近似范围内，而三个亲和力最高的样品位于纳摩尔以下的范围内。 图 4. 杂交瘤的快速动力学筛选，根据速率常数的估计值来评估。Kd估计值相对Ka估计值的对数图。红色对角线标出了对应 10、1 & 0.1 nM亲和力的等高线。阴性杂交瘤和极低水平结合物排除在此图外。 精选单克隆抗体的动力学鉴

11、定在数分钟内评估 速率常数 从快速动力学筛选中挑选出 16 个杂交瘤，提交给全面、高分辨率的动力学鉴定，此鉴定使用的分析设置与图 2 中描述的相似。不过，在这个例子中，使用了杂交瘤上清的更长时间注入，以便将捕获的单克隆抗体量最大化。在每个单克隆抗体上注入了一系列浓度的抗原 （从 3.3 到 270 nM） 。 利用这种方法，在过夜运行中鉴定了所有单克隆抗体（两组，每组 8个） 。利用自动的质量控制（QC）软件功能来验证数据集，这些数据组被拟合成 1:1 的相互作用模型，并用在专门的评估软件中推导动力学速率常数。 图5显示了所有16个单克隆抗体的动力学鉴定的拟合传感图数据，以及从每个例子的速率常

12、数比例推导而来的结合亲和力。 Biacore A100 中专门的评估软件能够在 10 分钟内完成这个分析，从打开结果文件到确定速率常数。单克隆抗体的亲和力从 62 到 1 nM 不等，有着多种结合和解离特征。这支持了从动力学筛选结果中选择 16 个单克隆抗体所使用的筛选标准。 图 5. 来自 16 个精选的单克隆抗体的动力学鉴定的拟合传感图。软件 QC 功能所鉴定出的少量非最优曲线被排除在数据拟合步骤之外。 动力学鉴定高分辨率选择亲和力相似的单克隆 抗体 16 个单克隆抗体覆盖了大约 60 倍的总亲和力范围，但是多数（16 个中的 11 个）落在大约 10 倍的范围内（21-2 nM） 。Bi

13、acore A100 所提供的高分辨率动力学鉴定能够根据具体的结合及解离速率常数，清晰地区分这些单克隆抗体（图 6） 。这个分析表明，单克隆抗体亲和力的差异主要是来自解离速率的差异，而并非结合速率，因为 Kd值变化了 55 倍，而 Ka只变化了 11 倍。 这种程度的动力学鉴定解析了亲和力近乎相同的单克隆抗体在结合性质上的重大差异。尽管图 6 中突出显示的 2 个单克隆抗体在亲和力上只相差 25%（分别为 21 & 16 nM） ，但它们的结合速率和解离速率动力学却相差近 10倍。这些动力学行为上的显著差异可能对最终的治疗应用有很大的意义，例如，慢的解离速率可能是临床成功的关键性质。 图 6.

14、 A) 16 个精选单克隆抗体的解离/结合速率图。 B) 非常相似亲和力的动力学分解。 A 图中突出显示的 2 个单克隆抗体 （1 & 2） 在亲和力上只相差 25%，但表现出完全不同的动力学特征。 动力学筛选作为真实动力学性质的预测器 对于这 16 个完全鉴定的单克隆抗体， 有可能将它们真实的动力学速率常数与单个抗原浓度传感图中所估计的值进行直接比较。图 7 显示了解离/结合速率图，其中比较了每个单克隆抗体的两组速率常数。高分辨率和速率常数估计值之间有着良好的关联，表明动力学筛选分析是一种非常有用的工具，能在大量杂交瘤样品中以所需的亲和力和动力学范围快速筛选候选物。这种比较还表明动力学筛查的

15、预测准确性是可变的，对于有着快速动力学的相互作用，准确性显著降低。因此，高效筛选单克隆抗体的最佳方法可能包括对有限数量的候选物进行完整的动力学鉴定，这些候选物是从动力学筛选中挑选出来的， 有着适当的结合特征。 如图所示， Biacore A100有力支持了这两个功能。 图7. 解离/结合速率图比较了从动力学筛选中估算出的速率常数近似值和从高分辨率动力学鉴定中推导出的速率常数。 在相等数值之间表现出更显著差异的单克隆抗体例子在图中圈出。 不同生物化学环境下单克隆抗体性能的平行分析 尽管抗体的筛选和选择条件必须为良好的分析性能而优化和标准化，但生物治疗剂必须在患者体内更复杂更多变的环境下发挥作用。

16、因此，在选择候选治疗剂时，单克隆抗体性能在各种生化条件下的稳定性也可能是感兴趣的。 利用 Biacore A100，相同的相互作用伴侣可利用四种不同的缓冲液平行分析。在这些研究中，挑选出 4 个单克隆抗体，用于 8 种不同的缓冲液条件下的动力学鉴定（运行缓冲液的 4 种不同盐浓度及 4 种不同 pH 变体） 。 由于改变缓冲液成分可能会影响 mAb-抗原和/或 mAb-捕获抗体之间的相互作用，所以使用了直接的固定策略（图 8） 。开展杂交瘤上清的快速纯化 （蛋白 A 亲和树脂） ， 以避免不想要的杂交瘤蛋白固定在传感器表面，并提高单克隆抗体的浓度，以实现最佳的固定水平。 抗原以 4 种不同的缓冲液制备，注射在各个流动槽中 相同的 4 个单克隆抗体固定在每个流动槽中 图 8. 在不同的缓冲液条件下，单克隆抗体的平行动力学鉴定的分析设置。 盐浓度从 50 nM 提高至 600 nM， 使 4 个单克隆抗体中的 3 个亲和力降低了 2-5 倍（图 9） 。但是，对于 mAb12，盐浓度对亲和力的影响非