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1、D O I:1 0. 3 7 2 4/S P. J . 1 0 9 6. 2 0 1 2. 1 0 9 6 1新型三唑类抗真菌活性化合物毛细管电泳手性拆分及 手性识别机理分子模拟研究李武宏 张欣荣 吴 思 谭光国 刘超美 朱臻宇 柴逸峰*( 第二军医大学药学院, 上海 200433)摘 要 研究了 7 种新型三唑类抗真菌活性化合物的毛细管电泳法手性分离,利用计算机辅助分子模拟技术研究拆分机理。考察了 8 种中性环糊精手性添加剂, 只有 2,6-二甲基-环糊精对 7 种活性化合物都有手性 识别能力。在 30 mmol/L NaH2PO4缓冲液中含 2, 6-二甲基-环糊精 30 mmol/L,
2、用 H3PO4调至 pH 2.2, 温度 20, 电压 20 kV, 在此条件下 7 种活性化合物都能达到手性分离, 其中 4 种活性化合物能达到基线分离(Rs1.5) 。应用计算机辅助分子模拟软件 Discovery Studio 2.5/Sybyl/Gold 模拟 2,6-二甲基-环糊精与 7 种活性化合 物主客体包结过程,并计算相互结合能, 探讨手性识别机理, 发现拆分结果与结合能的差异有关, 结合能差异越大拆分结果越好。关键词 毛细管电泳;三唑类;手性拆分;分子模拟2011-08-26 收稿; 2011-12-30 接受 本文系国家自然科学基金( No. 81072614) 和第二军医
3、大学博士创新基金资助项目 *E-mail: 1 引 言随着真菌感染特别是深部真菌感染病例大幅度上升, 深部真菌感染现已成为艾滋病和肿瘤等重大疾病死亡的主要原因之一。三唑类抗真菌药物为真菌羊毛甾醇 14 -去甲基化酶抑制剂, 是临床上应用最为广泛的抗真菌药物。由于已有三唑类抗真菌药物( 如氟康唑、 伊曲康唑等) 存在一定的毒性,且疗效不甚理想1。因此, 迫切需要研发出广谱、 高效、 低毒的新型抗深部真菌感染三唑类抗真菌药物。我院已合成大量新型三唑类抗真菌活性化合物26。这些活性化合物都具有 1,2,4-三氮环的结构, 其中 1-N通过一个亚甲基与手性碳原子相连, 与手性碳相连的其它两个基团分别为
4、 2,4-卤代苯环和烷基或一个不相同的取代苯环。已有报道证明唑类抗真菌药物的不同对映体对于细胞色素 P450 的抑制有差异7,8。因而有必要开展三唑类抗真菌活性化合物的手性分析研究, 以利于三唑类新药的光学纯度检测和手性立体选择性研究。目前, 用于分离三唑类抗真菌药物对映体的方法主要有 HPLC 法9、 CE 法1015和 SFC法16,17。本研究分析对象为叔丁基和烷基或一个不相同的取代杂环的新型三唑类抗真菌活性化合物,结构如表 1。目前尚未见采用环糊精作为手性选择剂拆分此类三唑类化合物的报道。表 1 7 种三唑类抗真菌活性化合物结构 Table 1 Chemical structure o
5、f seven trizole antifungal active compoundsStructureCompoundRCompoundR1CH2CHCH252CH2CH(CH3)263CH2CH374第 40 卷2012 年月分析化学 (FENXI HUAXUE) 研究 Chinese Journal of Analytical Chemistry第期请提供第一作者的手机号码以方便编辑部和作者联系,此号码不会公布在期刊中;请认真核实参考 文献的作者,期刊,年,卷,期,起止页码是否正确以及文献是否与文中一一对应李武宏，手机号：13818774352随着 CE 手性分离分析技术的发展, 大量手
6、性化合物得到了拆分, 同时, 关于手性拆分机理的研究也在逐渐深入, 但其微观机制难以用物理手段直接进行测量和表征。研究环糊精与对映体的包结作用机制, 可以在理论上解释环糊精手性识别的机理, 在应用上指导对映体手性拆分, 具有重要的意义。本研究选择上述分析对象, 借助于计算机辅助分子模拟软件 Discovery Studio 2.5/Sybyl/Gold, 采用分子对接方法, 确定 2,6-二甲基-环糊精( 2,6-Dimethyl-cyclodextrin, DM-CD) 与 7 种活性化合物主客体包结过程, 进而采用分子力学计算结合能, 通过计算机化的分子模拟技术从微观角度观察环糊精与对映体
7、的包合差异, 从主客体包结过程结合能差异考察, 验证实验现象, 为相似结构的三唑类抗真菌活性化合物手性拆分提供了理论依据和研究方法。2 实验部分2. 1 仪器与试剂3DCE 高效毛细管电泳仪( 美国安捷伦公司) ;二极管阵列检测器,ChemStation 工作站( 美国安捷伦公司) 。7 种三唑类活性化合物( 纯度大于 98%) 为我院有机教研室合成;-环糊精(-CD, 江苏昆山瑞斯克化工原料有限公司) ; -环糊精(-CD, 上海三杰生物技术有限公司) ; -环糊精(-CD) , 羟丙基-环糊精( HP-CD) , 羟丙基-环糊精( HP-CD) , 羟丙基-环糊精( HP-CD) , 2,
8、6-二甲基-环糊精( DM-CD) , 2,3,6-二甲基-环糊精( TM-CD) 均购自美国 Sigma-Aldrich 公司; H3PO4( 分析纯, 上海试剂四厂昆山分厂) ; NaH2PO4( 分析纯, 上海精化科技研究所) ; 甲醇( 色谱纯, 美国 Fisher 公司) 。实验用水为某品牌纯净水。2. 2 实验方法2. 2. 1 电泳条件 未涂渍熔融石英毛细管( 48.5 cm50 mm, 有效长度 40 cm, 德国安捷伦公司) ; 背景电解质溶液, 30 mmol/L NaH2PO4缓冲液, 用 H3PO4调至 pH 2.2, 分别含有 30 mmol/L 的-CD,-CD,H
9、P-CD, HP-CD, HP-CD, DM-CD, TM-CD, 或 10 mmol/L-CD; 进样条件, 压力进样, 5 kPa3 s; 检测波长:200 nm; 柱温:20; 电压:20 kV。进样间的冲洗, 先用 0.1 mol/L NaOH 冲洗 2 min, 水冲洗2 min, 然后用运行缓冲液冲洗 2 min。2. 2. 2 样品溶液配制 分别称取适量化合物 17, 用甲醇溶解, 配制成浓度约为 0.1 g/L 这 7 种样品。2. 3 分子模拟方法2. 3. 1 三维分子结构构建 对映体分子构建均采用 Sybyl 7.0 商业软件中 Sketch Molecule 完成, 然
10、后用标准分子力学方法进行能量优化。所采用参数为: Tripos 力场, Gasteiger-Hckel 电荷, Powell 能量优化方法, 迭代 1000 次, 能量收敛标准为 0.01 kcal/mol。各个异构体的构象的空间搜索方法采用分子动力学模拟退火, 所采用参数为: 模拟退火温度为 1000 K, 平台处理时间 1000 fs, 退火到 250 K, 时间 1500 fs,指数退火函数, 50 个循环。所有的分子力学和分子动力学计算都在 Origin 300 服务器上进行。环糊精分子构建取蛋白晶体结构库 PDB(http:/www.pdb.org)代码为 3M3R18的晶体结构,
11、从中提取-环糊精, 进而构建 2,6-二甲基-环糊精。采用前述 Powell 分子力学方法和模拟退火分子动力学方法进行优化, 得到 DM-CD 的三维分子结构, 用于后续的分子对接研究。2. 3. 2 分子对接 分子对接研究在 Dicovery Studio 2.5 软件平台中采用 GOLD version 3.0.1 商用软件进行19。将预先处理好的 7 种对映体分子对接到构建好的 DM-CD 的疏水空腔内。构象选择依据GoldScore 分数, 并参考相同构象出现的次数以及构象的合理性选取。2. 3. 3 结合能计算 结合能计算采用 Dicovery Studio 2.5 软件 Recep
12、tor-Ligand Interactions 中的 Calcu-late Binding Energies 功能。考虑构象熵选择 Ligand Conformational Entropy 为 True, 其它选项为默认。将上述分子对接后的主客体包合物依据软件中的结合能公式计算20:Ecomp=Ecomp-Eguest-Ehost( 1)其中,Ecomp为主客体包合物的能量,Eguest为客体分子的能量,Ehost为主体环糊精的能量。Ecomp数值越负, 表示包合物越稳定21,22。分 析 化 学第 40 卷3 结果与讨论3. 1 手性添加剂种类对手性分离的影响 在 2.2.1 节所述的电泳
13、条件下, 分别以-CD,-CD,-CD, HP-CD, HP-CD, HP-CD, DM-CD 和 TM-CD 为手性添加剂进行手性分离, 结果见表 2。由表 2 可知, 只有 DM-CD 对全部 7 种化合物有手 性选择性, 而 HP-CD 对全部 7 种化合物没有手性识别能力, 其余 6 种环糊精对这些化合物有部分分离能力。其原因可能是 2,6-甲基衍生化使 DM-CD 的环糊精空腔扩大满足环糊精与化合物包合, 同时环 糊精上未甲基化的 3 位羟基与对映体发生氢键作用, 满足手性分离的“ 三点作用机制” 。而其它环糊精可能由于空腔过小(-CD 和 HP-CD) 或者过大(-CD 和 HP-
14、CD) , 以及衍生化无法形成有效的氢键 作用, 未能满足“ 三点作用机制” , 从而无法达到分离。因此本研究选择 DM-CD 作为手性选择剂。表 2 环糊精种类对 7 种化合物手性分离的影响 Table 2 Influence of the cyclodextin (CD) type on the enantioseparation of compounds 1-7化合物 Compound分离度 Resolution (Rs)-CD-CD-CDHP-CDHP-CDHP-CDDM-CDTM-CD 1n. r.*n. r.0.92n. r.n. r.n. r.0.564.522n. r.2.42
15、n. r.n. r.3.54n. r.1.64n. r.3n. r.2.19n. r.n. r.2.73n. r.1.62n. r.41.09n. r.n. r.0.54n. r.n. r.0.890.385n. r.n. r.n. r.n. r.1.00n. r.1.73n. r.61.27n. r.n. r.0.72n. r.n. r.1.010.627n. r.0.55n. r.n. r.1.47n. r.2.80n. r.*:n. r., 没有分离度 (No resolution)。3. 2 手性添加剂的浓度对分离的影响 在拆分过程中, 环糊精的浓度是影响分离效果的重要因素。当环糊精的
16、浓度从零开始增加时, 对映体和环糊精接触的几率逐渐增大, 形成包合物的趋势亦增加, 达到某一环糊精浓度时, 分离达到最大。但随着环糊精浓度的增加, 从宏观角度来看, 溶液的粘度也随之增加; 而从微观角度来看, 环糊精上取代基的浓度也增加, 势必会增加对映体进入环糊精内腔的空间位阻。所以对映体的迁移率减小, 迁移时间图 1 DM-CD 浓度对 7 种化合物分离度的影响 Fig.1 Effect of the DM-CD concentration on the reso- lution of seven compounds增加, 同时对映体的平均迁移率之差也随之减小, 对分离不利, 因此, 在达到最佳浓度后继续增加环糊精的浓度, 分离往往随之变差。在 pH= 2.2 相同分析条件
