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1、微生物学通报 OCT 20, 2010, 37(10): 1440 1446 Microbiology China 2010 by Institute of Microbiology, CAS * 通讯作者：Tel: 86-10-68903622; : 收稿日期：2010-03-01; 接受日期：2010-07-16 研究报告 大肠杆菌的直流电场刺激过程 孙西同 马洁* 孙晓彦 刘镔 (首都师范大学化学系 北京 100048) 摘 要: 以钛网电极和铂网电极对培养瓶中大肠杆菌生长过程进行加电刺激, 研究其在直流电场作用下的生长情况, 并结合循环伏安扫描、恒电流、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝
2、胶电泳(SDS-PAGE)及测定菌体 ATP 酶活力等技术对大肠杆菌的直流电场刺激过程进行研究。结果表明, 在 00.2275 mA/cm2范围内, 随着电流密度的增加, 直流电场对大肠杆菌生长量的增长促进作用逐渐增加, 而 0.0455 mA/cm2的电场则是获得最大活菌量的最适电流密度; 通过对析氢活性不同的铂网电极与钛网电极通加相同电流密度的电场, 发现铂电极培养体系菌体生长优于钛电极培养体系菌体的生长。经验证发现引起这种变化的原因主要是水的阴极电解产物吸附氢和氢气比例的不同引起的; 同时发现在 0.091 mA/cm2电流密度下, 直流电场能有效提高 ATP 酶的活力, 在 8 h时通
3、电菌样酶活为不通电菌样酶活的 3.2倍; 通过对 0.0455 mA/cm2直流电场刺激后的菌体蛋白进行 SDS-PAGE 分析发现加电菌体在分子量 25 kD 与 35 kD 左右多肽表达量明显高于不加电菌体的多肽表达量, 而在分子量为 66.2 kD 左右时多肽表达量低于不加电菌体多肽表达量。 关键词: 大肠杆菌, 直流电场, 吸附氢, 氢气, ATP 酶 Electrolytic Stimulation of Escherichia coli by a Direct Current SUN Xi-Tong MA Jie* SUN Xiao-Yan LIU Bin (Department
4、of Chemistry, Capital Normal University, Beijing 100048, China) Abstract: Growth behavior of Escherichia coli (E. coli) under the exposure to direct current (DC) was studied in this paper, with electrolytic stimulation on the culture flask of E. coli using gauze titanium and platinum electrodes. The
5、 electric field-activated mechanism was also investigated by cyclic volt- ammestry technique, constant direct current technique, SDS-PAGE as well as enzyme activity assay of ATPase. The results show that direct current can promote the growth of E. coli under the current density of 0.2275 mA/cm2, and
6、 the growth speed is gradually accelerated with increasing current density, but 0.0455 mA/cm2 is the optimal current density to obtain the maximum viable cells. When the same cur- rent density electric field is applied to Pt electrodes and Ti electrodes, the Pt electrode culture system is superior t
7、o Ti electrode culture system. The cathode electrolysis products of water are the primary fac- tor for the difference, which include adsorbed hydrogen and H2. It is also found that the 0.091 mA/cm2 direct current can promote ATPase activity effectively, with 3.2 times at most after 8 hours. Bacteria
8、l 孙西同等: 大肠杆菌的直流电场刺激过程 1441 http:/ proteins about 25 kD and 35 kD are expressed higher while proteins of 66.2 kD are expressed lower af- ter (under) electrolytic stimulation of 0.0455 mA/cm2 direct current. Keywords: Escherichia coli, Direct current, Adsorbed hydrogen, Hydrogen, ATPase 微生物细胞的电解刺激(Ele
9、ctrolytic stimula-tion)技术是电化学与生物工程交叉领域的一个重要研究课题。目前这一技术已在酵母发酵体系1、生物脱氮体系24、污水处理和土壤修复57等领域中得到初步应用。在直流电解反应条件下, 酵母菌的酒精产量及生物脱氮速率均得到明显提高。在污水处理和土壤修复的生物反应体系中, 施加电场可以提高污染物的降解速率。但此方面的研究目前仍以现象观察为主, 对其作用机理尚无统一认识。She89以细菌 Enterobacter dissolvens 为研究对象, 考察了外加电场下 E. dissolvens 菌在酶的活性、生长、底物代谢等诸方面所受影响, 认为水电解产生的有氧条件的还
10、原性环境是细胞生长加快的原因。此外, 已有报道表明直流电亦可对微生物细胞施加负面影响1013, 甚至有杀菌的作用。因此为了进一步解释微生物的电场生物效应, 有必要将此方法拓展至更为广泛的微生物菌株类别, 并对细胞生长、酶的活性及蛋白表达等方面可能出现的变化进行综合考察。 大肠杆菌作为外源基因表达的宿主, 具有遗传背景清楚, 技术操作简单, 培养条件简单, 大规模发酵经济等优点, 倍受遗传工程专家的重视1415。目前大肠杆菌是应用最广泛、最成功的表达体系, 常做高效表达的首选体系。因此研究大肠杆菌电刺激作用具有很强的实际应用价值。本文以大肠杆菌为实验菌株, 综合考察了施加直流电场时该菌生长, 酶
11、活及蛋白表达诸方面可能受到的影响, 并结合电化学方法对直流电场的作用机理进行推测。其结果有助于丰富直流电刺激技术原理的认识, 并拓展其应用范围。 1 实验部分实验部分 1.1 仪器与试剂 VMP3 多通道电化学工作站(法国 Bio-Logic 公司); 可调式直流电源(金坛儒林电子仪器厂), 721B型分光光度计(上海第三分析仪器厂), MODEL-868型 奥 立 龙 (Thermo Orion)酸 度 计 (美 国 ORION), SHA-BA水浴恒温振荡器(金坛荣华仪器制造有限公司), VC130 型超声波破碎仪(美国 SONICS 公司), 3K15 型高速冷冻离心机(Sigma 公司
12、), CS501-SP 型超级恒温水浴锅(重庆四达实验仪器有限公司)。钛网电极(表观面积为 3 cm 3 cm, 通过测定电容值估算实际面积约为 220 cm2), 铂网电极(表观面积为3 cm 3 cm, 实际面积约为 52 cm2)。考马斯亮蓝蛋白测试盒(南京建成生物工程研究所), 超微量 ATP酶测试盒(同上), 酵母浸粉(北京双旋微生物培养基制品厂), 胰蛋白胨(同上), 细菌蛋白抽提试剂(北京康为世纪生物科技有限公司)。 1.2 实验菌种及培养基 实验所用大肠杆菌由北京市疾病预防控制中心自行筛选所得。 实验用培养基为 LB 液体培养基, 每升水中含胰蛋白胨 10 g, 酵母浸粉 5
13、g, 氯化钠 10 g, pH 7.0。 1.3 实验装置与培养条件 直流电解实验在三口玻璃电解瓶中进行, 加电阴阳两极均为钛网电极或铂网电极(间距 2 cm)。首先将大肠杆菌接种于装有 200 mL LB 液体培养基的锥形瓶中培养, 取对数期细菌培养液5 mL接种于装有 300 mL LB 液体培养基的电解瓶中加电处理 20 h, 摇床培养(温度 30C, 转速 130 r/min), 以不加电培养作为空白对照。 1.4 实验方法 1.4.1 大肠杆菌生长曲线的测定: 采用比浊法、稀释涂布平板法和培养基中菌体蛋白质含量检测法来表征细菌浓度。 比浊法为测定菌样在 660 nm 波长下的吸光度值
14、(OD660)。稀释涂布平板法为吸取少量培养菌液作系列倍数稀释, 各涂 200 L 菌液于 LB 固体培养基上, 37C 恒温培养 15 h 后计数。蛋白含量的检测法为考马斯亮蓝法, 操作方法为取3 mL样品于 5000 r/min 的转速下离心 20 min 后弃去上清液, 收集菌体; 然后洗涤数次重悬于生理盐水中; 再经超声波破碎, 最后用考马斯亮兰蛋白测试盒测定。蛋白含量定义为每升菌液中蛋白的质量: C =ACS / AS (1) 式中, C 为测定样品的蛋白含量(g/L), A 为测定管的吸光度值, AS为标准管的吸光度值, CS为标准1442 微生物学通报 2010, Vol.37,
15、 No.10 http:/ 管蛋白含量(g/L)。培养过程中每隔 2 h 取样测定菌液的吸光度值和蛋白含量来绘制生长曲线。 1.4.2 培养基 pH曲线测定: 培养过程中每隔 2 h取样测定菌液的 pH 绘制 pH 曲线, 以此表征直流电场对培养基酸碱性质的影响。 1.4.3 ATP 酶活性测定: ATP 酶活性用 ATP 试剂盒测定, 其活性单位定义为: 每毫克蛋白中, ATP 酶1 h 分解 ATP 产生 1 mol 无机磷的量为 1 个 ATP 酶活力单位, 单位为 mol/(mgh)。 AATP = 6 (A AC)CPn /ASC (2) 式中, AATP为测定样品的 ATP 活力, A 为测定管的吸光度值, AC为对照管的吸光度值, AS为标准管的吸光度值, CP为标准管的磷含量, n 为反应体系中的样本稀释倍数, C 为测定样品的蛋白含量。 1.4.4 电解产物对大肠杆菌生长作用分析: 采用析氢反应活性不同的钛网电极和铂网电极作为工作电极, 通加相同电流密度(0.0455 mA/cm2)的电场, 并结合电化学方法考察电解产物对大肠杆菌生长的影响。电化学曲线的的测定是以钛盘电极(实际面积约为 0.927 cm2)或者铂盘电极(实际面积约为0.418 cm2)为工
