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1、 原位所需试剂用 dH2O 配置，溶液高压灭菌 40min 即可。 材料固定材料固定 材料放入固定液中， 抽真空 1hr 至材料完全浸末到固定中， 更换新的固定液， 室温放置 36hr。 Fixative：4% paraformaldehyde, 0.25% glutaraldehyde (EM grade), 2.5ml 10XBuffer, 12.5ml distilled water, pH 7.27.4 Check pH 10% paraformaldehyde: 10 grams paraformaldhyde in 70ml distilled water. Add 1 drop
2、of 10N NaOH to stimulate solving and place for 20min at 70 (in waterbath).Adjust pH to 6.8 and volume to 100ml. (Solution can be stored in the dark at 4 up to one month) 10XBuffer=100mM sodium Phosphate pH 6.8 supplemented with 1M NaCl 68.4ml 0.1M Na2HPO4 31.6ml 0.1M NaH2PO4 5.84g NaCl 脱水、浸蜡脱水、浸蜡 1)
3、 Remove fixative and pass through the following dehydration steps: - 1X Buffer, H2O,10% ethanol, 30% ethanol, 50% ethanol, 70% ethanol, 80% ethanol, 90% ethanol and 96% ethanol for 20min; 100% ethanol for 3X1h 2) Remove ethanol and replace subsequently with xylene: - 1:3, 1:1, 3:1 ethanol:xylene; 2X
4、100% xylene, 60min for each step 3) Overlay xylene with molten paraffin. 3:1, 1:1, 1:3 xylene:paraffin, for two days at 60.100% paraffin for two days, and be replaced at least 4 times - 石蜡在脱水前要置于 60融化，过夜。 - Transfer the vials to 60 and pour off the paraffin-xylene solution quickly. 包埋包埋 适量 60的石蜡放入预热
5、的锡箔纸模具中，在石蜡的中的材料倒入其中。用解剖针和镊子 摆好材料的方向。模具放入冰上，待石蜡凝固后，4保存。 以上过程需要时间为一周左右。在此过程中，材料在固定液、100%乙醇、以及 3：1 的二甲 苯和石蜡的混合液中可以过夜。浸蜡过程需要 4-5 天时间。 准备 1.5mlEp 管，DEPC 处理的枪头，dH2O，DEPC 水 100ml，1M Tris-HCl pH8.0 Preparation of sildes（需要 2 天时间） 1) 盖玻片、载玻片的处理 - 洗洁精清洗载玻片（100 片）和盖玻片（300 片） ，自来水缓慢水流冲洗 2hr，10%HCl 浸泡过夜。市售盐酸浓度为
6、 36%。 - 载玻片装入提篮中，流水冲洗 2hr，晾干。盖玻片流水冲洗 2hr，100%乙醇漂洗，100% 丙酮 dip，晾干。锡箔纸包好载玻片和盖玻片，180烘烤 3hr。 Kaka2) 载玻片放入含有 100ug/ml poly-L-lysine (sigma) solution in 10mM Tris-HCl for at least 10min. Slides are air dried to obtain even coating of the slides. Store coated slides at -20 in a box sealed with tape. - Poly
7、-L-lysine can be stored at -20, preferably as a stock of 4 mg/ml 切片、脱蜡、检片切片、脱蜡、检片（2 天以上） - 将材料从 4拿出，室温放置 1hr 左右。 - Cut 8m think sections with steel knife, 连续切片。切好的蜡带置于电光纸上。 - coat 好的载玻片放于 42的烫台上，加 1ml DEPC 水。用针头把蜡带切成盖玻片长度， 挑取置于载片上。摆好蜡带之后，用吸水纸吸干载玻片上的水。 - 片子 42烘烤过夜。 - Put slides in 100% xylene for 30m
8、in; transfer the slides to 50% xylene (in 100% ethanol) for 20min; transfer the slides to 100% ethanol for 10min; Air dry the slides. - 镜检需要的片子，-20保存，待用。 探针标记探针标记（标记时间为 2 天） 1) 探针长度一般 5001000kb，连入 T-easy vector。鉴定插入的方向。SP6 作为引物测序， 如果方向与基因方向相反，则用 SP6 polymerase 合成出来的为 antisense probe，质粒 用 NcoI 酶切。T7
9、polymerase 则用 SalI 酶切质粒。Polymerase 在转录过程中，以 3-5 的链为模板，转录出 5-3的链。 （Promega 公司酶不错，NEB 的酶不好用，切记） 2) 原位探针标记体系: DNA template 9l (1g) 5XTrans Buffer 4l DTT(100mM) 2l RNA polymerase 2l RNA Inhibitor 1l rNTP-DIG labeling 2l total 20l 37 incubate 2.5hr 3) 反应结束后加 RNase free H2O 33ul DNaseI 2l DNaseI Buffer 6l
10、 Total 60l 37 incubate 1hr，取 1l 电泳检测 DNA 是否消化完全。 （是否有 DNA 残余，对后继实 验影响不大） 4) 在剩余溶液中加 0.5M EDTA 7.5l 4M LiCl 7.5l 100% Ethanol 225l -20 overnight 5) 12000g 4离心 20min，70% ethanol wash 沉淀，风干后溶于 20l DEPC 水中，取 1l 电 泳检测，并测 OD 定量(77B antisense 940ng/1l, clone 8; sense 860ng/1l, clone 4)。-20 保存备用。 KakaDAY1:
11、杂交前处理、探针消化、杂交过程一天内完成。早晨来后需打开 37水浴，蛋白酶 K buffer 预热，准备至少 6 个缸（可加 400ml 溶液） ，1L、500ml、200ml 干烤的玻璃两桶各 34 个， 需 1XPBS 大约 6L，sterile water 6L。 杂交前处理杂交前处理 1) 镜检的片子从-20拿出，室温放置至少 1hr 再打开锡箔。 2) 乙醇梯度：2X100%、90%、70%、50%、30%、10%、3Xsterile water，每个梯度 23min。 乙醇梯度可以重复使用于后面的脱水过程，100% ethanol 更换即可。 3） 100mM Tris-HCl p
12、H 7.5、 50mM EDTA 溶液先 37预热， 用前再加入 1g/ml Proteinase K， 枪头搅拌混匀。片子放入后，37处理 30min。 4) 2mg/ml glycine in PBS 溶液中 2min；PBS 溶液中 2minX2 （PBS 配制见前固定材料） 5）4% paraformaldehyde in PBS 10 min; PBS 溶液 5minX2 6）0.1M triethanolamine in PBS 中，pH 8.0 at room temperature for 10min。 3-乙醇胺为液体，M=149.称取 5.96g 要缓慢逐滴加入到 400m
13、l PBS 中， 并加入 1.6ml 浓 HCl 调节 pH。 7）在同一个缸中加入 0.25% acetic anhydride（400ml 溶液加 1ml）and incubate for 10min. 8) Sterile water wash 2minX3 9) Ethanol series: 10%、30%、50%、70%、90%、100%X2，各 2min。 10）真空干燥，大于 1hr。 探针消化探针消化 长片段的探针消化为大约 150bp 的片段， 后面杂交实验， 需要与没有消化的探针混合在一起 做杂交反应。因此只需消化一半用量的探针即可。 1) Mix 50l labeled
14、 RNA with 301l 0.2M Na2CO3 and 0.2M NaHCO3 0.2M Na2CO3 M=105.99 1.06g/50ml 0.2M NaHCO3 M=84.01 0.84g/50ml2) Incubate at 60 for the time calculated according to the formula: t=(L0-Lf)/(KXL0XLf) t= time in min, L0=starting length (in Kb), Lf=desired final length (in Kb), K=0.11 3) Stop the reaction by
15、 adding 3l 3M sodium acetate (pH 6.0) and 5l 10% glacial acetic acid. 80ml 水中加入 40.18g 三水乙酸钠， 冰乙酸调 pH 值 6.0， 定容到 100ml。 分装灭菌。 每张片子 100ng 探针。Antisense 27 张，sense 3 张。 1.5l antisene +48.5lDEPC+30l Na2CO3+20l NaHCO3 0.1875l sense+5l DEPC+3l Na2CO3+2l NaHCO3 Kaka杂交杂交 每张片子按所需杂交液为 150l 计算，其中 SolutionA:SolutionB 为 9:1，即 135l+15l 1) Solution A for 30 slides (135l/slide)： Formamide 2250l 3M NaCl 450l 1M Tris-HCl pH 7.5 45l 0.5M EDTA 9l 100XDenhardt 45l 50%Dextran sulfate 900l H2O
