《流式检测多功能th1细胞在结核感染中的应用》由会员分享，可在线阅读，更多相关《流式检测多功能th1细胞在结核感染中的应用（39页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、流式检测多功能流式检测多功能Th1Th1Th1Th1细胞在细胞在结核感染中的应用结核感染中的应用深圳市第三人民医院深圳市第三人民医院 深圳市肝病研究所深圳市肝病研究所 传染病研究中心传染病研究中心 张明霞张明霞研究背景Th1Th1Th1Th1细胞免疫及其分泌的细胞因子在结核病保护细胞免疫及其分泌的细胞因子在结核病保护 性免疫中起着必不可少的作用，结核菌抗原特性免疫中起着必不可少的作用，结核菌抗原特 异性异性IFN-IFN-IFN-IFN-或分泌单一细胞因子或分泌单一细胞因子IFN-IFN-IFN-IFN-的的Th1Th1Th1Th1细细 胞不能介导充分的免疫保护，其免疫水平与结胞不能介导充分的
2、免疫保护，其免疫水平与结 核病免疫保护效果无相关性，而是对体内结核核病免疫保护效果无相关性，而是对体内结核 菌抗原量的反映；菌抗原量的反映； 同时分泌同时分泌IL-2IL-2IL-2IL-2、IFN-IFN-IFN-IFN-和和TNF-TNF-TNF-TNF-的多功能的多功能Th1Th1Th1Th1细细 胞与结核疫苗诱导的保护性免疫密切相关；胞与结核疫苗诱导的保护性免疫密切相关； 结核疫苗诱导的小鼠肺内保护性免疫依赖于肺结核疫苗诱导的小鼠肺内保护性免疫依赖于肺 组织内多功能组织内多功能Th1Th1Th1Th1细胞免疫的产生；细胞免疫的产生； 多功能多功能Th1Th1Th1Th1细胞在人结核病保
3、护性免疫中的作用细胞在人结核病保护性免疫中的作用 仍有待阐明。仍有待阐明。研究内容探讨结核菌感染不同转归者外周血和肺内结核探讨结核菌感染不同转归者外周血和肺内结核 菌抗原特异性和非特异性多功能菌抗原特异性和非特异性多功能Th1 CD4 TTh1 CD4 TTh1 CD4 TTh1 CD4 T细细 胞存在的数量、比例、表型，及其与转归的相胞存在的数量、比例、表型，及其与转归的相 关性关性 ； 探讨潜伏感染者和结核病人肺内探讨潜伏感染者和结核病人肺内/ / / /胸腔积液中多胸腔积液中多 功能功能Th1Th1Th1Th1免疫与特异性细胞免疫效应功能的关免疫与特异性细胞免疫效应功能的关 系；系； 将
4、新近结核菌潜伏感染者按照其测定的多功能将新近结核菌潜伏感染者按照其测定的多功能 Th1Th1Th1Th1免疫水平进行分类随访，观察其两年内结核免疫水平进行分类随访，观察其两年内结核 病发病率，建立多功能病发病率，建立多功能Th1Th1Th1Th1免疫与免疫保护的之免疫与免疫保护的之 间直接联系。间直接联系。非特异性多功能Th1细胞的检测特异性多功能Th1细胞的检测研究方法 流式细胞技术检测胞内细胞因子的方法FCMFCM检测胞内细胞因子的方法特点检测胞内细胞因子的方法特点单个细胞水平进行测定，能够分析产生特定细单个细胞水平进行测定，能够分析产生特定细 胞因子的细胞亚群及其表型特征胞因子的细胞亚群
5、及其表型特征简单、快捷、灵敏简单、快捷、灵敏, , , ,可直接反映体内细胞的状态可直接反映体内细胞的状态实验结果客观实验结果客观, , , ,可反映细胞质中蛋白质的水平可反映细胞质中蛋白质的水平FCMFCM检测胞内细胞因子的方法学原理检测胞内细胞因子的方法学原理 激活免疫细胞（激活激活免疫细胞（激活T T T T细胞）；细胞）； 阻断胞内蛋白转运系统；阻断胞内蛋白转运系统； 增加细胞膜通透性；增加细胞膜通透性； 应用多色荧光标记抗细胞因子单克隆抗体；应用多色荧光标记抗细胞因子单克隆抗体； 结合细胞表型测定与胞内细胞因子检测。结合细胞表型测定与胞内细胞因子检测。FCMFCM检测胞内细胞因子的操
6、作程序检测胞内细胞因子的操作程序 非特异性刺激：非特异性刺激：PMA(50ng/ml)+Ionomycin (1 PMA(50ng/ml)+Ionomycin (1 PMA(50ng/ml)+Ionomycin (1 PMA(50ng/ml)+Ionomycin (1 g/L).g/L).g/L).g/L).刺激刺激1 1 1 1 小小 时后时后 BrefeldinBrefeldinBrefeldinBrefeldin A (10 A (10 A (10 A (10 g/ml)g/ml)g/ml)g/ml) 特异性刺激：特异性刺激：MtbMtbMtbMtb裂解液裂解液/BCG(10ug/mL
7、)/BCG(10ug/mL )/BCG(10ug/mL )/BCG(10ug/mL )非特异性刺激实验过程250uL全血+750uL的完全1640刺激培养，PMA +PMA +PMA +PMA +IonomycinIonomycinIonomycinIonomycin ，37孵育1小时加入BFA继续培养5小时，用PBS洗涤2mL溶血素溶血固定10分钟后，PBS洗涤用1mL破膜剂重悬细胞，室温避光40分钟， PBS洗涤加入荧光标记抗体,室温避光30分钟，洗涤1%PFA重悬细胞，流式细胞仪检测结果分析特异性刺激实验过程分离PBMC,调细胞浓度1x106/mL ,加Mtb/BCG刺激， 37CO2孵
8、育8小时加入BFA继续培养6-8小时，用PBS洗涤2mL溶血素溶血固定10分钟后，PBS洗涤用1mL破膜剂重悬细胞，室温避光40分钟， PBS洗涤加入荧光标记抗体,室温避光30分钟，洗涤1%PFA重悬细胞，流式细胞仪检测结果分析1 1 1 1、非特异性多功能、非特异性多功能Th1Th1Th1Th1细胞的检测结果细胞的检测结果CD3CD3CD3CD3+ + + +CD8CD8CD8CD8+ + + +TNF-aTNF-aTNF-aTNF-aTNF-aTNF-aTNF-aTNF-aCD3CD3CD3CD3+ + + +CD8CD8CD8CD8- - - -55.555.555.555.512.41
9、2.412.412.421.821.821.821.810.310.310.310.335.535.535.535.548.248.248.248.23.03.03.03.013.213.213.213.20.70.70.70.718.418.418.418.43.33.33.33.377.677.677.677.64.24.24.24.244.144.144.144.13.23.23.23.248.548.548.548.533.233.233.233.29.89.89.89.817.917.917.917.939.139.139.139.14.24.24.24.255.555.555.55
10、5.54.34.34.34.36.76.76.76.71.41.41.41.43.03.03.03.09.39.39.39.386.386.386.386.36.56.56.56.560.060.060.060.07.17.17.17.126.426.426.426.449.349.349.349.37.17.17.17.125.025.025.025.018.518.518.518.539.039.039.039.049.549.549.549.56.56.56.56.55.05.05.05.019.819.819.819.826.426.426.426.452.852.852.852.81
11、.01.01.01.017.617.617.617.618.418.418.418.418.418.418.418.445.645.645.645.6TBTBTBTBLTBILTBILTBILTBIHDHDHDHDIFN-rIFN-rIFN-rIFN-rIL-2IL-2IL-2IL-2P+IP+IP+IP+I非特异性刺激非特异性刺激0 0 0 01010101020202020HD LTBI TBIL-2 TNF- IFN-+ + + + + + + + + + + +- - -CD4 T cellCD4 T cellCD4 T cellCD4 T cell cytokine expressi
12、on(%)cytokine expression(%)cytokine expression(%)cytokine expression(%)0.00.00.00.02.52.52.52.55.05.05.05.0HD LTBI TBIL-2 TNF- IFN-+ + + + + + + + + + + +- - - -1010101020202020303030304040404050505050CD 8 T cellCD 8 T cellCD 8 T cellCD 8 T cell cytokine expression(%cytokine expression(%cytokine exp
13、ression(%cytokine expression(%AB流式细胞仪检测外周血多功能T细胞IL-2、TNF-a、IFN-r表达：A:90 例健康对照（HD）、108例潜伏感染者（LTBI）、111例结核患者 （TB）；B：10例健康对照、6例潜伏感染者、28例结核患者0 0 0 01010101020202020AFB- AFB+IL-2 TNF- IFN-+ + + + + + + + + + + +- - - -CD4 T cellCD4 T cellCD4 T cellCD4 T cell cytokine expression(%)cytokine expression(%)cy
14、tokine expression(%)cytokine expression(%)0 0 0 0252525255050505075757575AFB- AFB+IL-2 TNF- IFN-+ + + + + + + + + + + +- - - -CD8 T cellCD8 T cellCD8 T cellCD8 T cell cytokine expression(%)cytokine expression(%)cytokine expression(%)cytokine expression(%)AB流式细胞仪检测外周血多功能T细胞IL-2、TNF-a、IFN-r表达：A： 55例痰涂片阴性（AFB-）结核患者、36例痰涂片阳性（AFB+）结核 患者；B： 23例痰涂片阴性结核患者、2例痰涂片阳性结核患者05101520PTB TP*IL-2 TNF- IFN-+ + + - + - - + - + + - + - + +
