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1、型肝炎及相關肝病動物模式土撥鼠之飼養管理及實驗技術台灣獸醫誌型肝炎病毒的發現及證明其在慢性肝炎與肝 癌上扮演很重要的角色是世紀醫學上的重要發 現之一 ，直到今天，型肝 炎病毒感染仍是造成人類急性及慢性肝炎之主要原 因之一，全球約有億的慢性肝炎帶原者，面臨發 展 成 肝 硬 化（）及 肝 細 胞 癌（ ）等致命疾病的威脅 ， 。早年研究型肝炎是以黑猩猩（ ）當實驗動物，由於其可被型肝炎病毒感 染，因此是藉以了解急性型肝炎病毒感染之致 病 模 式 與 發 展 疫 苗 上 相 當 重 要 的 實 驗 動 物 ，但由於其感染肝炎病毒後，除了可 引起急性與慢性肝炎外，並不會引發肝細胞癌 ，加上牠屬於保育
2、類動物，價格昂貴且取得 不易，照顧又費力，因此限制了其在型肝炎病毒研究上的普遍利用性。在年，等 人發表了篇報告，指出在費城動物園（ ）中的土撥鼠已連續年有 很高的慢性肝炎發生率，其中在屍解時發現 有肝細胞癌，並且分離到種不管在基因體構造或 生物學特性上皆與人類型肝炎病毒有高度相似 性 的 病 原，該 病 原 稱 之 為 土 撥 鼠 肝 炎 病 毒 （，） 。土 撥鼠肝炎病毒，具有宿主專一性，只能感染土撥鼠 而不會感染人類。而土撥鼠感染該病毒（自然感染 或實驗室接種病毒感染）後的病程和人類感染 型肝炎病毒非常類似，也會造成慢性肝炎和肝癌。 研究顯示，初生土撥鼠經實驗方式感染土撥鼠肝炎 病毒後，約
3、有以上的機率可成為終生慢性帶 原，同時這些慢性帶原鼠在年內有近的機 率會演變成肝細胞癌 。和黑猩猩比較，土撥 鼠又有體型小，照顧容易又不是瀕臨絕種的保育類型肝炎及相關肝病動物模式土撥鼠之飼養管理及實驗技術林琇玲陳培哲劉俊人高嘉宏陳定信李碧珍吳慧琳國立台灣大學醫學院附設醫院肝炎研究中心台北市 國立台灣大學臨床醫學研究所、內科台北市 國立台灣大學醫學院實驗動物中心台北市（收稿日期：94 年 6 月 25 日。接受日期：95 年 1 月 16 日）摘要林琇玲等動物的優點，因此，土撥鼠成為研究人類型肝 炎病毒複製、自然病史、致病機轉及防治方法最好 的動物模式之一。此外，由於人類帶原者需 年才發展成肝癌
4、的過程在土撥鼠只需年，大幅 縮短了觀察及研究的時間，所以土撥鼠也是研究肝 癌成因及治療很重要的動物模式 。 台灣為一個型肝炎流行區域，究竟如何利 用預防及治療的技術來控制型肝炎病毒感染， 一直是一個刻不容緩的課題。到目前為止，還沒有 一種治療方法能有效去除帶原者體內的病毒，台大 醫院肝炎研究中心一直致力於研發新的治療方式來 治療慢性型肝炎及相關肝細胞癌。為了測試這 些新療法安全性及效果，本中心選擇並引進土撥鼠 做為型肝炎的動物模式。土撥鼠俗名，學名 ，與海狸、松鼠、花栗鼠等，皆屬於齧齒目 動物的一支松鼠科（） 。約個月達性 成熟，體重約公斤，成鼠體重公斤。牠在冬 眠（不進食、不進水）後，初春醒
5、來時體重下降至 約公斤左右，一直到秋季體重又會因進食而直線 上升至公斤，累積的皮下脂肪可提供冬眠所需 之能量。冬眠醒來後配種，孕期天，出生體 重為公克， 週離奶， 年分娩次，產子 數約隻，於實驗室中飼養的土撥鼠，在沒有生 病的情況下可存活年 。 本院肝炎研究中心自年月起，由美國 引進第批土撥鼠肝炎病毒帶原土撥鼠隻，之後 每年陸續引進，至民國年底為止，前後引進 批土撥鼠（共計隻） ，其中隻帶原，隻不 帶原。已建立土撥鼠的飼養及繁殖環境，土撥鼠房 的環境溫度需控制在攝氏度，光照週期亦需 做適當的調整，來掌控其冬眠期。此外亦發展相關 實驗技術及生化檢測方法、進行肝臟超音波以追蹤 肝癌之產生；選殖土撥
6、鼠肝炎病毒及數種土撥鼠基 因、以進行疫苗治療慢性肝炎及肝細胞癌基 因治療之研究。土撥鼠由大草原移到實驗室中飼養，必須解決 以下問題： 冬眠期之控制：冬眠長短可經由控制其生活 環境來調控，將室溫控制在攝氏度，再改變光週期就可調控冬眠期並影響其分娩季節。我們給予 之光照週期如下（） ，此週期得使它們在 月左右開始進入冬眠， 月初冬眠醒來。冬眠時土 撥鼠體溫由降至與室溫相同，呼吸約每分月份光照時間（）型肝炎及相關肝病動物模式土撥鼠之飼養管理及實驗技術鐘次，心跳也由每分鐘次降至次。 食物的種類： 餵高纖兔料（） ，偶而再補充紅蘿蔔與蘋果。 籠舍的設計：長公分、寬公分、高 公分之不鏽鋼籠舍，須相當堅固，
7、可防止土撥 鼠脫逃，也容易清理，可保持乾爽。在籠舍內加置 個可提式遮蔽箱，供其躲藏（） 墊料之給予：每日需更換木屑墊料，因為土 撥鼠具有挖洞習性，須舖設公分厚墊料，供其挖 洞。 籠舍之清潔：先將躲在遮蔽箱內的土撥鼠取 出放在另一空籠中，取出底盤將舊松木屑剷除，再 以次氯酸鈉（高利士）加入公升溫 水（最終濃度為）來擦拭底盤及籠內架，放 入新木屑，再將土撥鼠放入。 爪子的修剪：使用小動物指甲修剪器定期修 剪，必須注意不要剪到血管。 土撥鼠的繁殖：肝炎研究中心引進之土撥鼠 目前已成功繁殖出胎（分別為 ， ， ， ， ， 及隻） ，共計隻，存活隻，隻死亡， 其中第胎的隻小土撥鼠，是在本院實驗動物中 心
8、繁殖出來，由於母鼠棄養，改為母兔代為哺乳， 但由於兔奶無法消化而引起小土撥鼠脹氣，因此於 出生後天全數死亡，另外胎是經由與台北市立 動物園合作，藉園中的環境設備繁殖成功。保定與採血在保定上需要穿戴長筒的皮製厚手 套，不可將手指頭戴到底，因為土撥鼠會快速咬住 皮手套指尖端。一人壓住土撥鼠的頭部及背部，再 由另一人將麻醉藥物（體重 體 重）施打在其 後大腿外側之肌肉。待其被麻醉後，再以一手抓住 頭頸後方，另一手撐住身體後半腹部，勿只用單手 抓取背部或腹部，以免造成橫膈疝氣（ ）或滑落。再將土撥鼠以仰躺於工作台 之姿勢，用一手壓其大腿內側，使大腿外側平貼在 工作台上，另一手則輕壓其鼠蹊處，尋找脈動，
9、再 以真空採血針頭垂直插入脈動處，碰到骨頭後將真 空管壓入針頭，再將針頭慢慢向上拉回到股動脈 （） ，並使針頭停留在可使血 液噴入管中（） ，待採血結束，拔出針頭，用 手指緊壓採血點止血分鐘後，放回籠內待其甦醒。心臟採血則僅於安樂死時才實施。較長時間的麻醉先將土撥鼠用前述方法麻醉 後，再 以（ 體重）注射於 舌於下靜脈，或直接施以體重 加體重之劑量進行麻醉。超音波技術之應用首先將土撥鼠麻醉後，將其 右腹部橫膈下方的毛剔除，塗抹上傳導膠（）後，以機型（ ）加上 適當的探頭（）進行腹部超音波掃描， 以檢查肝腫瘤的發生及其狀況（大小和數目） （） ，此外，在進行肝臟活體組織之切片（ ）或基因治療時（
10、） ，亦需在超音 波的指引下找到確切之位置。（）血液 生化值之監測我們是採用的儀器設備 （） ，搭配生研實驗套組（ ）來偵測血青中的濃 度，我們發現當大於時，即可在超音 波檢查中發現直徑約公分大小的肝腫瘤結 節。土撥鼠胎兒甲型蛋白（）基 因的選殖胎兒甲型蛋白是篩檢肝細胞癌及追蹤 肝細胞癌治療最常用的標記，但由於胎兒甲型蛋白 有種別特異性（） ，因此肝炎研究 中心於肝細胞癌組織中抽取，再利用 中的其他物種胎兒甲型蛋白基因之高 保存（）區，設計引子進行反轉錄 （）製備來選殖土撥鼠 的胎兒甲型蛋白基因。選殖到的土撥鼠胎兒甲型蛋 白的經定序確認後 （約個基對） 已登錄 到的中 （） 。 完成定序，並已
11、表現蛋白及製備其抗體，未來可發 展成檢測土撥鼠肝癌的生物標記（） 。肌肉免疫注射（） 肌肉進行免疫施打技術，毫升的注射針筒 將（土撥鼠肝炎病毒之）注射至脛 骨前頭肌（） ，再用電擊器 （林琇玲等）電擊，增加轉染（ ）到細胞的效率。由於土撥鼠的體型與兔子相 當，因此，我們是應用兔子的條件來進行電擊，即 是以伏特， 毫米電極間距的條件加以電擊， 電擊時間長度為毫秒，電擊間隔毫秒， 次電擊後，改變電極方向，再次電擊，而兔子則 是用相同的電擊條件，但為次的連續電擊，不改 變電極方向 。骨髓細胞之採集採集骨髓細胞前，我們先將土 撥鼠麻醉並採取趴姿置於手術台上，將其髖部的毛 剔除並清潔消毒，再以骨髓穿刺針
12、（內徑 長度， ）由其腸骨脊（）處採集其骨髓細 胞，或是針對安樂死之土撥鼠，在其股骨（ ）處，以骨剪剪斷，並用針筒注射生理食鹽水 進入股骨，沖洗出骨髓細胞。我們以抽取出來的骨 髓細胞，評估我們選殖到的土撥鼠 （ ）基因所表現出來的蛋白質，是否有促使骨髓 細胞生長分化的生物活性（） 。病毒之定性及定量分析由血清中抽取土撥鼠 肝炎病毒後，依照已發表之土撥鼠肝炎病毒 基因序列設計引子後，再以聚合脢連鎖反應 （，）進行定性分 析，以點漬分析（）或定量（ ）進行定量分析。藥物之人工餵食有些藥物之投予方式以口服為 佳，在餵食飼料前給予。用米麩和水，溶成稠狀， 裝於針筒中，用手推送。自行接種土撥鼠肝炎病毒成
13、為帶原土撥鼠根 據文獻報告，有種方式可使土撥鼠在感染土撥鼠 肝炎病毒後，有較大的機會成為帶原者。 是在土 撥鼠於出生後小時內即用皮下注射方式進行感 染，另一是先利用免疫抑制藥（ ）抑制免疫反應後再進行感染 。第批在 本院出生的小土撥鼠我們用第種方式進行感染， 我們將 病毒顆粒注射到出生後天的新生 土撥鼠，不過由於母鼠一開始就一直不願意帶仔 鼠，所以新生土撥鼠天後全數死亡，無法分析； 為了盡量減少對新生土撥鼠的干擾，後來本中心用 第種方式進行感染。離奶後之土撥鼠（約週大）先以體重的劑量餵食 週之後，再給予病毒顆粒進行感染，並在 感染後持續再餵食兩週的，利用此方 法我們已可成功感染小土撥鼠成帶原土
14、撥鼠，目前 嘗試過隻仔鼠， 隻成功，成功率。局部脫毛與褥瘡我們為了防止土撥鼠脫逃及清 洗上的方便，所以飼養籠採用不銹鋼材質，但由於 其不銹鋼材質的關係，對部分土撥鼠循環有不良影 響，會在臀部尾根處產生脫毛，甚至容易有褥瘡。皮屑當土撥鼠肝功能受損，肝指數上升時，免 疫力下降，易在胸腹部產生皮屑。慢性肝炎病毒帶原土撥鼠發展成肝細胞癌的情 況土撥鼠在發展成肝細胞癌之前並不會有肝硬 化之現象 ，但我們可以在肝癌組織中看到 增生（）的肝細胞、肝細胞癌前趨細胞 及肝癌細胞，此外，亦可見到在肝癌組織中再衍生 另一較小之肝癌節結（） ，較大之肝癌腫塊亦 常有壞死現象，在肝癌組織之周圍有明顯的發炎現 象，會有多
15、量之單核細胞浸潤。年引進隻 型肝炎帶原土撥鼠中，除了隻非因肝癌死亡 外，另外隻皆死於肝癌，皆在年內發展出肝癌 並死亡，而肝癌發生（以血清生化及肝臟超音波為 依據）至死亡的時間間隔，視其腫瘤發展之情況而 有不同，以我們目前的觀察，大多為至個 月，其中隻為個月，由於目前觀察到的樣本數 並不多，須累積足夠之樣本數才足以下結論。 年引進的隻帶原土撥鼠，其中隻（ 隻為肝安能加疫苗治療組另隻為控制組） 死於肝癌。肝安能加疫苗治療組：肝癌開 始時直徑公分，經過個月後發展至直徑 公分，並有小結節瀰漫性分布於肝臟，直徑都在 公分以下，雖然該土撥鼠在治療過程中，病 毒力價明顯下降但仍發生肝癌並死亡，由此可知病 毒
16、力價與其發生肝癌之情況並不相關；控制 組：其肝癌模式為除了顆直徑公分之腫瘤 外，亦瀰漫分布針點狀之肝癌組織，它在冬眠開始 時，肝臟生化指數急劇上升，並且死亡，該土撥鼠 之病毒力價一直相當高。由這兩批土撥鼠發生肝癌 及死亡時間間隔來看，有經藥物及疫苗治療 的土撥鼠，其肝癌發作到死亡時間的間隔較長，同 時也發現這兩批土撥鼠的肝癌型態不盡相同，型肝炎及相關肝病動物模式土撥鼠之飼養管理及實驗技術年那批腫瘤多為單顆，但年度那批則除了單 顆或多顆較大的腫瘤外，亦有瀰漫性針點狀腫瘤分 布。由於土撥鼠會冬眠，因此，實驗的設計需配合 其冬眠期。冬眠對土撥鼠有其必要性，若不冬眠脂 肪無法消耗，容易衍生心血管方面的問題。土撥鼠 的體重以年為週期發生變化，若用實驗室老鼠 飼料來餵食，會發生心臟血管疾病，甚至發生動脈 硬化。由於土撥鼠非常容易脫逃，所以我們為每 隻土撥鼠設計個不鏽鋼籠舍，由於土撥鼠會怕 人，所以為避免其驚慌，在籠舍內加置個可提式 遮蔽箱，供其躲藏，此外，此一設計亦可提供一個 很好的土撥鼠生理狀況指標。我們
