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1、r 5 2 7 6 3 2原创性声明本人声明:所呈交的硕士学位论文，是本人在指导教师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中己经注明引用的内容外，本论文不包含任何其它个人或集体均己经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人或集体均已在文中以明确方式标明，本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位沦文作者签名:日期几 弄 亡 弓 年月( 。 日关于论文使用授权的说明本人同意学校有权保留并向国家有关部门送交学位论文的复印件，允许论文被查阅和借阅。同意学校及国家有关机构可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存论文。论文作者签名:日期:指导教师签名:日
2、期:提要透明 质酸( H y a l u r o n i c ) 是一种独特的线性大分子粘多糖。因其高 度的粘弹性、 可塑性、 渗透性和良 好的生物相容性， 作为一种可吸收、 可降解的生物材料己 广泛应用于临床医学和高级化妆品领域。本实验以产透明质酸的野生菌株一溶血性兽疫链球菌为原出发菌株，经N T G ( N 一 甲 基一硝基- N 一 亚硝基肌， 以 下简称N T G ) 诱变获得非溶血性菌株并提高其透明 质酸的产量。 优化了培养基组成和发酵条件以及添加不同增强剂而使透明质酸的产量进一步提高。并且研究了透明质酸的提取方法。本次实验，获得以下结果1 .经多次N T G诱变获得了非溶血性菌株，
3、产量提高了0 .3 7 倍。2 采用均匀设计优化培养基组成及发酵条件培养基组成为: 葡萄糖6 . 0 %;蛋白 脉1 .5 %; 酵母膏0 . 5 %; 磷酸二氢钾。 .2 %;氯化钙0 .0 0 5 %;精氨酸0 . 1 2 %;谷氨酸钠。 . 5 %.发 酵条 件为: 3 7 0C : 接 种量1 2 % ; 加液量2 8 m l/ 2 5 0 m l ; p H值7 .0 同时加入p H调节剂 ( 1 ) 2 % a3 .添加增强剂A和增强剂B均可提高H A产量率，其适宜浓度分别为。 . 0 6 % 和 2 . 5 %.在 上 述 条 件 下 透 明 质 酸 的 产 量 由 原 始 菌
4、株 的0 . 1 2 7 幼提 高 到0 .5 8 1 幼，产量提高了3 . 5 8 倍。4 .初步建立了透明质酸提取工艺流程。绪论透明 质酸( H y a l u r o n i c A c i d ， 以 下称 H A ) 是一 种独特的 线性大分子 粘多糖， 由葡萄糖醛酸和 N 一 乙酞氨基葡萄糖的双糖单位反复交替连接而成， 分子式为( C 1 4 H 2 1 N 0 1 1 ) n ， 依据组织来源不同， 分子量变化于 1 0 5 -1 0 7之间 ，H A广泛分布于动物和人体结缔组织细胞外基质中， 在眼玻璃体、 脐带、皮肤、软骨和滑液中含量较高， 血清中含量最低， 与其它天然粘多糖不
5、同 ，H A分子内 不含硫酸基团 ， 也不与蛋白 质共价结合， 能以自 由 链形式在体内游离存在.早期研究认为H A仅是一种细胞空间 填充物， 未能引 起人们重视，但在过去的1 0 年里， 随着对H A结构、 性能、生物功能认识的深入，,H A己 成为细胞生物、 病理、 免疫学等领域的研究热点.H A因其高度的粘弹性、可塑性、渗透性和良 好的生物相容性， 作为一种可吸收、可降解的生物材料， 已广泛应用于临床医学和高级化妆品生产.近年来H A的市场需求与日 俱增表现出良 好的市场潜力和广阔的应用前景H A作为一种可吸收的高 分子医 用材料， 己 成功地运用于眼科手术、 关节病治疗和组织修复等领域
6、， 并诞生了粘弹性外科和粘弹性物补充疗法的医学新概念.H A通过吸收震动、润滑细胞层， 使组织免于受手术工具的机械损伤， 它代表手术实施的媒介， 避免生成组织粘结， 使血块和组织碎片易于除去. 在生物性修复术中，H A可隔离组织表面，作为一种机械保护剂， 在手术后可防止粘连及纤维性组织形成. 高浓度、高分子量的 H A不但能抑制出 血， 减少能形成永久粘连骨架的血块数量， 而且能抑制成纤维细胞的运动和活性.C a z z o l a等以鼠主动脉平滑肌细胞作试验， 发现分子量为 2 x 1 0 6的H A能影响平滑肌细胞的 扩散及其a 一 行为的表述， 认为H A能影响伤口 处成纤 维 细 胞的
7、 扩 散 ， 减 轻 或 避免 肥 厚 性 伤疤的 形 成，婴儿 伤口 愈 合后 不 会留 下伤疤， 也被认为是伤口 处一直存在高浓度 H A的结果.H A对鼓膜穿孔愈合的加速作用己得到临床验证人体血液中 H A含量的 变化也可作为疾病诊断的一种指标， 用来辅助诊断某些疾病， 现己 发现， 肝硬化病人血清中H A的 含量会增加1 0 1 0 0 倍，肝脏移植后 H A含量增加则是组织排斥的早期标志， 其它疾病如败血病、肿瘤、关节炎等也会引起血清中H A含量的增高。早在2 0 世纪8 0 年代初，H A优异的保湿功能就受到了国际化妆品界的广泛关注。富含透明质酸的化妆品可以 从真皮中汲取大量水分。
8、同时，由于表皮脂层质屏障作用， 可以防止水分蒸发与散失， 达到维持皮肤水环境的恒定作用。 无论在低湿度还是在高湿度条件下， 它都具有相同的高吸湿性。因此，它被当作一种理想的天然保湿因子，广泛应用于化妆品中，制成适合不同肤质、气候、环境下使用的产品。H A 还能 改 善 皮 肤 生 瑾 条 件， 为 真 皮 胶 原 蛋白 和 弹 性 纤 维 的 合 成 提 供优越的外部环境， 加强营养物质的供给， 起到护肤养颜的效果。 研究表明，透明 质酸可以阻止细胞中一些酶的产生， 减少自由基的形成， 在防止自由基破坏细胞结构、产生脂质过氧化和引起肌体衰老等方面起着重要作用:低分子量的H A具有抗炎、 抑制病
9、菌产生、 保持皮肤光洁的作用;为细胞增殖与分化提供合适的场所，直接促进细胞生长、分化、重建与修复等。因 此， 它被作为高档膏霜、 乳液、 化妆水、 美容液、口红、 粉底等化妆品和盛洗用品必备的添加剂， 以达到增湿保湿、 嫩肤抗衰老和抗皱消炎等功效。目 前， 含有这种成分的化妆品被公认为“ 仿生化妆品， 备受推崇。 添加H A的化妆品己成为国际日 化界的主流产品。一、H A 的生产方法目前国内H A的生产方法主要有动物组织提取法，微生物发酵法。己有报道称日本已实现了人工合成透明质酸.1 动物组织提取法是利用天然原料即从动物组织中提取， 主要原料是人的脐带、 鸡冠和牛眼玻璃体等。 用丙酮或乙醇将原
10、料脱脂、 脱水、 风干后， 用蒸馏水浸泡、过滤， 然后以氯化钠水溶液和氯仿溶液处理， 之后加入胰蛋白酶保温后得到混合液， 最后用离子交换剂进行处理、 纯化得到精制的 透明质酸。 1 9 3 4年M e y e r 和P a l m e r p 首 次 制 备H A 的 方 法 是向 玻 璃 体 滤 液中 直 接加 入 冷 丙酮沉淀出H A 。然后再用水提取，经冰醋酸反复沉淀， 提高H A的纯度。5 0 年和6 0 年代发展成为把动物组织剪断后用丙酮等有机溶剂脱脂 2 1 ， 用蛋白酶进行处理， 然后溶出、 分离、 精制、或者将脱脂后的动物组织用大量的 水或盐溶液 提取分离8 1 ， 从而获 得
11、H A 。 为防 止 在提取H A的 过 程中有 硫酸软 骨素 提出，日 本专 利 4 1 报道 将冷丙 酮 解冻 温度控制在 3 5 - 6 5 0C ,时间3 0 - 3 0 0 m i n ， 蛋白 酶反 应 温度限 制在3 5 - 6 0 0C 。 日 本专利4 1 还报道了 将动物组织用4 级0 .0 2 - 1 .0 %的钱盐溶液热处理后，用蛋白酶反应 5 小时抽提H A的 方 法 5 1 。 山 东 医 科 大 学 8 1从8 0 年 代 初开 始 研究H A的 动 物 组 织 提取法，取得成效。并于 1 9 8 5 年从牛眼玻璃体中制备H A无菌制剂应用于眼科的骨科临床。组织提
12、取法生产H A , 原料有限，成本高， 难以大规模生产， 价格均十分昂 贵。 由 于 从动物组织里 提 取的H A 和其 他蛋白 质及糖结合 成复 合体6 1分离 和精制比 较困 难。 另外， 在提 取的H A中 亦含有H A酶( h y a l u r o n i d a s e ) ,因此提取过程中H A被分解，低分子化，所得H A的保温性和粘性降低。2 .微生物发酵法以葡萄糖作为碳源，以酵母萃取物和蛋白 陈作为氮源。 在培养基中发酵4 8 小时，发酵结束后，过滤除去菌体和杂质，然后用醇沉淀法等简单操作即得到高纯度的产物。 采用发酵法制造的透明质酸， 优点是能按商品设计来设定分子量。 发酵
13、法的关键在于菌种的选择，目前多选用链球菌属类菌种。 生物发酵法具有产品不受原料资源限制， 生产成本低， 工艺简单( 无需复杂纯化工艺)等特点口1 )产生H A的菌种1 9 3 7 年F .E .K e n d a ll 等 (7 ) 发 现 链球 菌( S t r e p t o c o c c u s ) 属中 具 有。 溶 血性的A型菌种酿脓链球菌 ( p y o g e n e s ) 能 产生H A 。 该菌株分离自 被感染的人体，具有强的病原性。1 9 3 9年S e a to w等 报 道了C型菌马 链 球菌 ( S .e q u i ) 和兽 瘟 链 球菌( S .z o o e
14、 p i d c m i c u s ) 也能产生 H A ， 前者从马的上呼吸道中， 后者从马或牛的口鼻腔中分离得来。两者均为0 溶血性链球菌。随后， M a c l e n n a n 等在1 9 5 6 年， H o l m s t i o i n 等在1 9 7 6 年， J .B e r g a r 等在1 9 6 9 年， C i f o n e l l 等在1 9 7 0 年分别发现似巴 链球菌 ( S .e q u i s i m i c l i s ) .停乳 链球菌 ( S .d y s g a l a c t i a l ) . 粪链 球菌 ( S .f a e c a
15、l i s V a r . z y m o g e n e s ) 和多杀性氏 代杆菌 ( P a s t e u r e l l a m u l t o c i d a )等菌株均具有产生H A的能力8 1 9 7 6 年K j e m s 等 19 1报 道了 一 种 从 合 成 培 养 基 上 的 链 球 菌 培 养 液中( A组1 2 型， K 5 6 菌株)制备H A的方法，即将培养4 8 小时后的培养液经蒸汽灭菌、 过滤、 滤液用乙醇沉淀得粗品， 然后悬浮于醋酸钠缓冲溶液中溶解并离心，上清液用两倍体积无水乙醇沉淀得片状H A 。在以后的研究过程中Ma c l e n n a n 发
16、现能产生H A的A群和C群菌株在好气条件下的H A产量高于厌气条件，非H A酶菌株的生产性能好。 在工业上， 利用链球菌属的菌种， 从培养液中提取H A并精制的方法最先是日 本人4 1 报道的。链球菌 ( S t r e p t o c o c c u s )是属于革兰氏阳性球菌的链球菌科 ( S t r e p t o c o c c a c e a e ) ， 链 球 菌 属 p o t 。 本 菌 广 泛 分 布 于自 然 界 ， 如 水、 空 气、土壤、人和动物的上呼吸道和肠道。本菌为圆型或卵圆型， 常排列成链状。 链的长短与菌的种类及生长环境有关。 大多数链球菌幼龄培养时可见到荚膜， 继续培养后则消失， 不形成抱子， 多数无鞭毛。 能利用葡萄糖， 一般不利用菊糖， 不能还原硝酸t 1生长 最适温度为3 7 0C ， 最适p H为7 .4 - 7 .6 。 多 数致病菌的生长营养要 求高，在普通培养基上生长不良， 需在含有血液或血清的培养基中才能生长发育好 1 11链 球 菌 可 根 据 其 在 血 琼 脂 平 板的 溶 血 作 用
