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1、潍 坊 医 学 院硕 士 学 位 论 文题 目二甲双胍对去势大鼠垂体内分泌功能及瘦素受体 mRNA 表达的影响院、系（所） 基础医学教学部 专 业 药 理 学 学 位 类 别 医学科学学位 研 究 生 殷 昭 珍 导 师 康康 白白 教教 授授 论文起止日期：2008 年 2 月2009 年 03 月目 录一、中文摘要1二、英文摘要3三、符号说明5四、正文前言 6材料与方法 8结果16讨论18结论37五、附图表38六、参考文献48七、致谢58八、攻读学位期间发表的学术论文目录59二甲双胍对去势雌性大鼠垂体内分泌功能的影响及其机制的研究研 究 生殷 昭 珍 专 业药 理 学 指导教师康 白教授中
2、文摘要中文摘要目的：目的：研究二甲双胍 (Metformin, MF) 对去势雌性大鼠垂体(pituitary)内分泌功能、超微结构及对垂体中瘦素受体 (Ob-R) mRNA 表达的影响。以探讨该药对垂体内分泌功能的作用及作用机理，为发现 MF 临床新用途，指导临床合理用药等提供理论依据。研究方法：研究方法：用生理盐水 (normal saline , NS) 配制成含MF30mg/ml的溶液。选健康成年雌性未孕SD大鼠40只，随机分为四组，每组10只，(1) 正常对照假手术组 NS 5 mlkg-1d-1；(2) 单纯去势(OVX)模型组 NS 5 mlkg-1d-1；(3) 去势二甲双胍低
3、剂量组 MF 135 mgkg-1d-1 ；(4) 去势二甲双胍高剂量组 MF 270 mgkg-1d-1，ig，连续用药30天。于末次灌胃12h后，经颈总动脉取血约5 ml，离心得到血清样品，-20冷冻保存待用。用放射免疫分析法(RIA)测定 MF对去势雌性大鼠血清雌二醇(E2)、孕酮(P)、黄体生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)和瘦素(LEP)含量的影响。同时迅速取大鼠垂体，一部分制备电镜标本，观察 MF对去势大鼠垂体内分泌细胞超微结构的影响；另一部分放入冻存管，立即置于液氮(-180)中保存，提取腺垂体的 mRNA，采用-肌动蛋白(-actin)作为内参模板，用实时荧光定量逆转录聚合酶
4、链反应(RT-PCR)技术进行扩增，以去势大鼠瘦素受体 mRNA 和-actin mRNA 扩增产物量的比值来衡量MF对去势大鼠垂体瘦素受体 mRNA 表达水平的影响，琼脂糖凝胶电泳确定扩增产物的特异性。整个实验过程中，大鼠每隔6天称重一次，并以此调整给药剂量，同时观察 MF 对去势大鼠体重的影响。结果：结果：OVX大鼠血清E2和P的含量显著降低(P0.01)，而LH、FSH和LEP则显著升高（P0.01）。MF 135 mgkg-1d-1，ig，连续用药30 d，可使OVX大鼠血清LH含量明显降低（P0.05），而FSH、E2 、P和LEP的水平则无显著影响(P0.05)；MF 270 mg
5、kg-1d-1，可引起OVX大鼠血清LH和LEP的含量明显降低（P0.01, P0.05）,E2 、P水平则显著升高（P0.05），而FSH含量则无明显改变(P0.05)。电镜观察显示，OVX组大鼠腺垂体促性腺激素细胞与正常对照组比较，超微结构呈现分泌旺盛的表现：线粒体呈板层状，有大量管状嵴线粒体，内质网扩张，细胞质中分泌颗粒明显增多。用药组和OVX组比较，促性腺激素细胞内分泌颗粒明显减少。OVX 组瘦素受体 mRNA 表达较正常对照组明显降低（P0.05），用药组与OVX 组比较则无明显改变(P0.05)。MF 270mgkg-1d-1，可显著降低去势大鼠体重(P0.05).MF(270 m
6、g/(kgd),ig,30 d) decreased serum LH and leptin (P0.01，P0.05) while increased serum E2 、P concentrations significantly(P0.05), but had no effects on serum FSH concentration (P0.05).MF (270mgkg-1d-1)decreased evidently body weight in OVX rats.KEY WORDS: Metformin; pituitary; endocrine function; ultros
7、tructure; lepti receptor; reverse transcriptase-polymerase chain reaction(RT-PCR)符号说明（按首字母顺序）符号说明（按首字母顺序）缩写英文全名中文全名BMIbody mass index身体体积指数cDNAcomplementary DNA 互补 DNADEPCdiethylpyrocarbonate 焦炭酸二乙酯DMdiabetes mellitus糖尿病E2estrodiaol雌二醇EDTAdisodium ethylene diamine tetracetate乙二胺四乙酸二钠FFAfree fatty ac
8、ids 游离脂肪酸FSHfollicle stimulating hormone卵泡刺激素GnRHgonadotropin releasing hormone促性腺激素释放激素HDLhigh-density lipoprotein高密度脂蛋白HPGAhypothalamus-pituitary-gonad axis下丘脑-垂体-性腺轴HPOAhypothalamus-pituitary-ovary axis下丘脑-垂体-卵巢轴IGFBGIGF-binding protein胰岛素生长因子结合蛋白IGF-1insulin-like growth factor-1胰岛素生长因子Insinsulin
9、胰岛素IRinsulin resistant胰岛素抵抗LEPleptin瘦素LHluteinizing hormone黄体生成素LHRHluteinizing hormone releasing hormone黄体生成素释放激素MFMetformin二甲双胍mRNAmessenger ribonucleic acid信使核糖核酸NPVneuropeptide Y神经肽 YNSnormal saline生理盐水Pprogesterone孕酮PCOSpolycystic ovarian syndrome多囊卵巢综合症RIAradio-immunoassay放射免疫法RT-PCRreverse tr
10、anscriptase-polymerase chain reaction逆转录聚合酶链反应Ttestosterone睾酮TAEtris-acetic acid electrophoresis(buffer)Tris-乙酸电泳缓冲液TrisTris(hydroxymethyl)aminomethane三(羟甲基)氨基甲烷Oligo(dt)oligodeoxythymidylic acid寡聚脱氧胸甘酸rpmrevolution per minute每分钟转数WHRwaist-hip ratio腰臀比前前 言言二甲双胍(Metformin,MF)属于双胍类口服降糖药，主要用于非胰岛素依赖型糖尿病
11、(DM)的治疗，目前已被认为是胰岛素增敏剂之一。随着对其药理作用的深入研究，该药不仅作用于下丘脑-垂体-胰腺轴，还具有促进垂体-卵巢轴分泌的功能1，目前临床亦用于多囊卵巢综合征(Polycystic ovary syndrome，PCOS)的治疗，改善月经，促进排卵，提高妊娠率。但MF对因卵巢功能障碍，导致雌激素水平低下患者的生殖内分泌功能的影响，国内外鲜见报道。MF对性腺轴的影响机制尚未完全阐明，作用部位也不十分明确。而在分子生物学方面的研究较少，尤其是MF对血清瘦素含量及垂体-靶腺轴瘦素受体(Ob-Rb)mRNA 的表达所产生的影响未见报道，本实验就瘦素在垂体-性腺轴中的作用及其机制进行研
12、究和探讨。瘦素(1eptin)是1994年鉴定的由肥胖基因(obese gene，ob基因)编码的产物2，是一种具有146个氨基酸的蛋白质，它主要由由白色脂肪组织合成分泌3。瘦素作为一种脂肪细胞因子参与体内各种重要生理及病理活动的调控，其中一个重要方面就是对生殖系统功能的影响4, 脂肪组织所分泌的雌激素和瘦素对性发育、青春期的萌动及与月经调节均有十分重要的作用，瘦素的正常分泌对维持正常月经周期和排卵相当重要，低脂妇女血清瘦素水平降低，其抑制促性腺激素的释放，从而导致排卵和月经周期紊乱。大量文献表明LEP对神经内分泌、卵巢、子宫内膜和部分生殖病理等有重要的调理作用，对促性腺激素释放激素(GnRH
13、)、黄体生成激素(LH)、卵泡刺激素(FSH)等生殖相关激素的分泌也有重要的调节作用。作为一种蛋白或肽类激素，Leptin必然是通过靶细胞膜上的受体和相应信号转导体系发挥作用，受体后机制是通过JAKSTAT信号转导途径实现的，主要活化JAK2一STAT3途径。瘦素受体属I类细胞因子超家族的一种，分为两类5：一种是长链型(ObRb)，主要在下丘脑表达；另一种是短链型(ObRa， 一Rc， 一Rd，Re，Rf)，在全身都有表达。目前已证实，两类受体均可转导瘦素的代谢作用信号(激活JAKs)，但只有长链型受体可以通过STATs路径转导细胞内信号。Zomorano(1997)研究表明，在动物性腺、垂体
14、和下丘脑均发现有瘦素受体，瘦素可与下丘脑一垂体一性腺轴各部位上受体结合而调控生殖活动，也可与生殖轴上任一部位上瘦素受体结合实现其调控生殖活动的作用6。免疫细胞化学和免疫荧光双标研究显示，腺垂体LH、FSH、GH、PRL细胞上均有Ob-R表达7。本研究旨在应用放射免疫分析法、电镜技术和实时荧光定量逆转录聚合酶链反应等方法，从功能、形态学和基因表达三个角度来研究MF对大鼠腺垂体-性腺轴内分泌功能的影响，为探讨药物对内分泌功能的作用及机理，发现MF新的临床用途，指导临床合理用药提供理论依据。 材料与方法材料与方法一、实验材料(一)、实验动物健康成年雌性未孕 SD 大鼠 40 只，体质量(20020)
15、g，由山东大学实验动物中心提供，动物批号： SCXK 鲁 20030004。(二)药品与试剂二甲双胍(MF)：北京中惠药业有限公司生产，批号：20080310。用生理盐水(NS)配制成浓度为 30 mgml-1的溶液。黄体生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)、孕酮(P)、雌二醇(E2)放免试剂盒：潍坊三维生物工程集团有限公司。瘦素(LEP)放免试剂盒：北京普尔伟业生物科技有限公司。UNIQ-10 柱式 Trizol 总 RNA 抽提试剂盒(UNIQ-10 Column，2.0-ml Collection Tube，Trizol，RPE Solution，DEPC-H2O)：上海生工生物工程技术服务有限公司 AMV 第一链 cDNA 合成试剂盒(5Reaction Buffer，dNTP Mi
