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1、DNA的粗提与鉴定 四个标准n所得DNA的纯度应满足下游操作的要求；n所得DNA应当完整；n所得DNA应有足够的量；n如果是对植物进行大规模的筛选，还应当 满足操作程序快速，简单，价格低廉，并 尽量避免使用有毒试剂。一、实验目的 掌握DNA提取技术操作原理培养分子生物学实验操作能力和观察能力 。二、实验原理n通过去污剂破碎细胞膜，释放出基因组 DNA，利用DNA不溶于乙醇的特点从细胞 粗提液沉淀出DNA分子。最后通过核酸特 异染料二苯胺进行鉴定。 n实验材料：新鲜菜花药品：nDNA提取液（1000 ml）：秤取Tris 10.1 g，先加入50 ml蒸馏水溶解，然 后用浓HCl调pH至8.0，
2、再加入NaCl 8.76 g， EDTA 37.2 g， SDS 20 g，待药品全部溶解后 定容至1000 ml。n二苯胺试剂的配置：称取1.5克二苯胺，溶于100mL冰醋酸中，再加 1.5mL浓硫酸，用棕色瓶保存。临用前，在 10mL的上述溶液中再加入0.1mL体积分数为 0.2%的乙醛溶液。药品在DNA提取中的作用nNaCl: 高盐去除糖类，中和DNA侧链的磷酸根离子 的负电荷，以减少DNA分子之间的排斥，便于沉淀。nTris(三羟基氨基甲烷) ：和HCl一起构成缓冲对，能 维持提取溶液pH 环境。nEDTA（四乙酸乙二胺二钠）： 螯合剂，能螯合 DNA 酶活性所需的Mg2+,防止DNA
3、被DNA 酶降解。nSDS（十二烷基硫酸钠）：去污剂，破坏细胞膜， 变性蛋白，抑制DNA 酶活性。 n二苯胺：核酸特异染料四、实验步骤：取5g菜花顶花部分放入研磨过滤器中，加入 5 ml DNA提取液，充分研磨。将研磨液转移置10 ml离心管中， 65保温10 min。6000rpm离心10min。取上清液至另一个10 ml离心管中。加入等体积的氯仿：异戊醇（24：1），混匀。12000rpm离心10min 。小心吸取上清液至另一个10ml离心管中。加入2倍体积的 100%乙醇，混匀，会看到白色絮状沉淀，可用玻璃 棒挑，此为粗提植物基因组DNA。弃去乙醇，吹干沉淀后溶于1ml灭菌重蒸水中。二苯
4、胺鉴定：在上述DNA溶液中加入1ml二苯胺试剂，混匀。在另一 只管中加1ml灭菌重蒸水和1ml二苯胺试剂，混匀，作为不含DNA对 照。将两管在沸水浴中煮10 min,在加热过程中随时观察溶液颜色变化。移液器的使用说明 微量可调移液器是一种在一定范围内可连续调 节的移液器，主要用于少量液体的定量量取。使用方法：n 使用时将移液器刻度调整到需要量取 的数值上，安上相配套的吸头；将取液按 钮按到一档后（感觉有明显阻力）将吸头 插入需量取的液体中，缓缓松开按钮，液 体即被吸入吸头内；缓缓将按钮按到一档 将吸头内液体排入所需容器，23秒后将 按钮按到二档后（不可以再往下按）将残 留液体排出即完成取液，使
5、用后使用褪管 按钮将吸头放到废物杯中。 注意事项：使用时不可猛吸猛排，以防溶液进入管腔 内，影响密闭并造成污染。管内吸有液体时禁止将移液器平放，以防 液体进入管腔内。刻度调节不可超过刻度范围，以防卡死。 二苯胺鉴定DNA用琼脂糖凝胶电泳（0.8%）检测核 DNA的完整性 紫外分光光度计检测DNA的浓度和纯度n用紫外分光光度计在230nm、260nm、 280nm 和310nm波长分别读数。其中260nm读数用来 估计样品中DNA的浓度，OD260/OD280与 OD260/OD230的值用于估计DNA的纯度，310nm 为背景吸收值。1个OD260值相当于50g/mL双 链DNA。n样品浓度（g/mL）=（OD260- OD310）稀释倍 数50n对于DNA纯制品，其OD260/OD280 1.8， OD260/OD230应大于2。OD260/OD280 1.8 说明 有RNA污染；OD260/OD2801.8说明有蛋白污染 。
