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1、植物组织植物组织/ /细胞技术细胞技术课程实习指导课程实习指导X 生物 081-082 班2011 年 5 月- 1 -实习安排与要求实习安排与要求一、一、实习实习安排安排1.实习时间：本次教学实习时间 3 天，具体时间安排为 2011 年 5 月 25 日至 27 日；2.实习地点：生物技术实验室；校园。3.实习内容与进度：时间教学实习内容实习地点指导教师5.25 上午X 生物 081，实习所需试剂准备， 实验楼 D302杨靖；孙海燕5.25 下午X 生物 081，原生质体的游离与培养，X 生物 082，植物快繁体系外植体选择与预处理实验楼 D302，304校园杨靖；孙海燕5.26 上午X
2、生物 082，实习所需试剂准备， 实验楼 D302杨靖；孙海燕5.26 下午X 生物 082，原生质体的游离与培养，X 生物 081，植物快繁体系外植体选择与预处理实验楼 D302，304校园杨靖；孙海燕5.27 上午X 生物 082，植物宝宝培养，植物快繁体系建立实验楼 D302，304杨靖；孙海燕5.27 下午X 生物 081，植物宝宝培养，植物快繁体系建立实验楼 D302，304杨靖；孙海燕二、二、实习实习成成绩绩考核考核实习成绩考核采用百分制记录，总成绩由考勤成绩、实习报告成绩、实习操作成绩组成。其中，考勤成绩占总成绩的 20，实验操作成绩占 40%，实习报告成绩占总成绩的 40%。三
3、、三、实习实习要求要求1、指导教师全面监管实习过程中的纪律，负责实习时间安排与安全防护；各行政班班长、学习委员以及各实习小组组长负责具体实施。2、实习过程中实行组长负责制：每班学生分为 6 组，每组 5-6 人，每组推荐组长 1 名，对本组组员负责召集、组织、安全监督和出勤记录；各班班长和学习委员对本班各组进行统一管理，对各自的班级负责。3、实习过程中要遵从指导教师的统一安排，做到遵守纪律，井然有序。树立良好的时间观念，遵守实习进度安排，不迟到，不早退。遇到问题及时与指导教师联系：杨靖（手机 15837383387） 孙海燕（手机 13569401693）4、在实习过程中要按章操作，注意保护所
4、用仪器，同时要注意自身的人身安全，特别是对高压蒸汽灭菌锅、蒸馏水器等易造成人身伤害的仪器，使用一定要小心进行；对升汞等有毒试剂的处理也要特别小心。5、实习前和实习过程中，进行必要的文献资料查阅和理论知识准备；理论联系实际，实习中要勇于发现问题，积极分析问题和解决问题。6、整个实习过程要严肃认真，科学求是，确保实习质量。7、实习结束后，根据实习要求、实习内容、自己的感受，进行认真整理，及时详细地写出实习报告。- 2 -实习一实习一 原生质体分离与培养原生质体分离与培养一、实验原理一、实验原理植物原生质体是除去了细胞壁的仅为质膜所包围的的裸露细胞。植物的细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质构成。一
5、般而言，纤维素占到细胞壁干重的 25%-50%，半纤维素占到细胞壁干重的 53%左右，果胶质一般占细胞壁的 5%左右，根据不同的植物细胞特性，选择不同的纤维素酶、果胶酶（有的材料需加入半纤维素酶）可有效的去除细胞壁，而不伤害细胞本身，从而获得大量的具有活力的原生质体。由于原生质体内部与外界环境间仅隔一层质膜，因此，原生质体分离和培养过程中必须保持在渗透压平衡的溶液中才能保持其完整性和活力，所以在原生质体的分离、纯化和培养的早期都应当给予适当的渗透保护。由于原生质体具备了完整的细胞器和细胞结构，与植物细胞一样具有全能性，在合适的离体培养条件下具有分裂分化和再生成为完整植株的能力。植物原生质体培养
6、就是通过原生质体的分离、纯化、培养，得到再生植株的过程。植物原生质体的分离与培养具有重要意义：在基础研究方面，可利用原生质体研究细胞壁的再生，研究质膜的结构与功能以及在能量转换、物质转换以及信息传递等方面的作用；研究病毒侵染、复制的机理。在植物生理学研究方面，原生质体成为研究植物生长调节物质的作用、植物代谢以及其他生理问题的工具。利用原生质体易破碎的特点可以分离得到大量而完整的细胞器用于各种研究。由于原生质体具有全能性及能摄取外源细胞器、细菌、病毒、质粒及 DNA 大分子等特点，因此是进行遗传转化研究的理想工具。原生质体由于无壁，所以能超越细胞间的不亲和障碍，便于进行各种远缘种间细胞杂交，可通
7、过融合等技术将外源遗传物导入其内从而培育新品种。二、实验目的二、实验目的学习和掌握原生质体制备和培养的方法。三、实验器材三、实验器材超净工作台、显微镜（6 台） 、高压灭菌锅、摇床、低速离心机（配 10ml 带盖具刻度离心管） 、微孔滤膜过滤器、不锈钢网(200-250 目)等。每实验组所需要的物品见表 4-1。四、实验药品与材料四、实验药品与材料1试剂溶液试剂溶液（1）酶混合液：先配酶储备液/洗液(CPW+10%甘露醇)灭菌待用，实验时再按比例加入纤维素酶（1%，Onozuka R-10，Japan）和果胶酶（1%，Pectinase、Serva）（2）洗液：CPW+10%甘露醇。CPW 溶
8、液：KH2P04 27.2 mg/L, KN03 101 mg/L, CaCl2.2H20 - 3 -1480 mg/L,MgS04.7H20 240 mg/L, KI 0.16 m g/L, CuS04.5H20 0.025 mg/L，pH 5. 6)。（3）质壁分离液：12%甘露醇（4）漂浮纯化液：CPW+22%蔗糖（5）原生质体培养基：MS+6BA(0.5mg/L)+NAA(1mg/L)+2,4-D (0.5mg/L)+10%甘露醇2实验材料实验材料烟草无菌苗叶片或盆栽烟草中部叶片。表 4-1 每组所需要的物品列表 编号物品数量用途备注 1注射器及细菌过滤器1 套酶液过滤 2吸管10 支
9、吸出/加入液体3漏斗（内装 200 目钢网）1 套过滤酶解-原生质体混合 液 410ml 带盖刻度离心管2 支盛装原生质体离心、纯化将这些物品分类用 报纸（或牛皮纸） 包严，放入灭菌铝 盒内高压灭菌后备 用。5培养皿（盛有平板培养 基）2-3 皿培养原生质体需高压蒸汽灭菌6培养皿（内放滤纸 3-4 片）1-2 个材料切割平台需高压蒸汽灭菌7广口瓶（盛无菌水）6 个 （或 2 个）盛无菌水；材料灭菌与质 壁分离用需高压蒸汽灭菌850ml 空玻璃三角瓶1 个盛叶片进行酶解需高压蒸汽灭菌9三角瓶5 个盛装质壁分离液、酶混合 液、洗液、漂浮纯化液、 原生质体清洗培养基除酶混合液外都需 高压蒸汽灭菌10
10、镊子、剪刀1 套材料切割与夹取需灼烧灭菌 11其他封口膜、标签纸、废液缸、铅笔等注：如果使用无菌烟草叶片，准备“广口瓶（盛无菌水） ”1-2 个即可。五、实验步骤五、实验步骤1. 培养基及试剂的配制培养基及试剂的配制（1）CPW 溶液：按照 CPW 配方称取各试剂，先配制成扩大 10 倍的母液，使用时再稀释 10倍， （KI 、CuSO4.5H20 用量甚微，可事先配制成扩大 1000 倍的母液） ，调整 PH 到 5.6 备用。（2）质壁分离液（12%甘露醇）：每组 30ml。（3）酶混合液：将称量好的纤维素酶与果胶酶加入到酶储备液/洗液（CPW+9%甘露醇）中，即配制的酶混合液。使用前需经
11、过滤灭菌。一般酶制剂都不太纯，配好后要经 3500rpm 离心5min，弃去其中杂质，吸取上清液进行过滤灭菌备用。每组需要大约 15ml。（4）洗液（CPW+10%甘露醇）：每组 40ml。（5）漂浮纯化液（CPW+22%蔗糖）：每组 20ml。（6）原生质体培养基：按配方配制原生质体培养基，一部分作为原生质体悬浮用，不加琼脂，分装灭菌备用，每组需要大约 15ml；另一部分加入琼脂在培养皿中倾倒 1.5mm 厚的平板（10ml/培养皿） ，每组 2 套。附：配制所需试剂小组分工明细：附：配制所需试剂小组分工明细：- 4 -第 1 组：配制质壁分离液 200ml，准确称取甘露醇 24g，加蒸馏水
12、定容至 200ml，平均分装至6 个试剂瓶中，高压蒸汽灭菌。第 2 组：配制酶储备液 200ml，准确称取甘露醇 18 g，加 CPW 溶液至 200ml，置于试剂瓶中，高压蒸汽灭菌。第 3 组：配制洗液 250ml，准确称取甘露醇 25 g，加 CPW 溶液至 200ml，平均分装至 6 个试剂瓶中，高压蒸汽灭菌。第 4 组：配制漂浮纯化液 200ml，准确称取 44 g 蔗糖，加 CPW 溶液定容至 200ml，平均分装至 6 个试剂瓶中，高压蒸汽灭菌。第 5 组：配制液体培养基 200ml，平均分装至 6 个试剂瓶中，高压蒸汽灭菌。第 6 组：配制固体培养基 250ml，平均分装至 12
13、 个培养皿中，高压蒸汽灭菌。2原生质体的分离原生质体的分离（1）材料称取与质壁分离对于盆栽材料：对于盆栽材料：称取 1g 材料，先切成大块（灭菌时在广口瓶中摇晃转开即可）装入塑料广口瓶中，在超净工作台上进行灭菌处理（75%酒精 30S，之后用 0.1%升汞灭菌 7-8min，无菌水冲洗4-5 次） 。对于无菌材料对于无菌材料：在超净台内将无菌烟草叶片从培养瓶内取出，放入无菌广口瓶（或三角瓶）内萎蔫 20min。向广口瓶（或三角瓶）中加入灭菌处理的质壁分离液（12%甘露醇） ，使叶片质壁分离 0.5h，滤去甘露醇，将材料用灭菌的镊子夹取，转到垫有滤纸的培养皿中，吸干叶片表面水分，用小镊子撕去叶片
14、下表皮及叶脉，将叶片剪成 0.5cm2的小块（不易太小，否则会得到过多地破碎细胞） 。注：或先剪碎再质壁分离。（2）酶解将切碎的材料投入到玻璃三角瓶中（灭菌过） ，用注射器抽取酶混合液 12ml（材料和酶解液的体积大约 1：10） ，装上细菌过滤器（用无菌镊子夹取） ，向下缓缓轻压，将酶液过滤到三角瓶中。黑暗下酶解 1.5-2 小时，中间轻晃几次（或黑暗振荡培养，保持 27oC，酶解 1-2h，振速为5060r/min） 。在酶液消化过程中，由于实验材料的个体差异，酶解时间不固定，因此要用显微镜随时检查酶解情况。方法是：轻微摇动正在酶解的酶消化液，在超净工作台上，用灭菌过的吸管灭菌过的吸管吸取
15、少量酶消化液，加到载玻片上，盖上盖玻片后显微镜下观察，若看到叶片细胞壁已降解，且有大量圆球形原生质体释放到溶液中，即终止酶解。用吸管轻轻压挤叶片，以释放出全部原生质体。3原生质体的收集与纯化原生质体的收集与纯化（1）取出装有酶解好材料的三角瓶，在超净台工作台内，将酶-原生质体混合液经 200 目筛网过滤（不锈钢网目的大小视分离的原生质体大小而异） ，未消化完的细胞团或组织留在不锈钢网上面。过滤液收集于 10 mL 刻度离心管中，盖盖 800-900r/min 离心7min，使悬浮的原生质体下降至离心管底部。- 5 -（2）缓缓倾倒出上清液（或用灭菌吸管吸去上清液） ，留沉淀即为收集的原生质体。
16、向离心管中缓缓加入洗液CPW+10%甘露醇6-8ml，轻轻摇动（或在加洗液时用吸管轻轻吹打轻轻吹打使其悬浮） ，使沉淀悬浮（用力不可太大，以免原生质体破裂） ，800r/min 离心 6min，弃上清液，留沉淀。重复此过程一次。此过程的目的是用洗液将原生质体表面的酶混合液洗干净，以免在以后培养时残留的酶液会影响原生质体壁的再生。（3）加入洗液 5ml，使原生质体悬浮，显微镜检查清洗后的原生质体，如碎片过多，则用蔗糖漂浮法去除碎片。蔗糖漂浮方法：用细口长吸管长吸管吸取漂浮纯化溶液CPW+22%蔗糖5ml，小心插入盛有原生质体悬液的离心管底部，缓缓将蔗糖溶液挤出。由于比重不同，蔗糖溶液与原生质体悬液中间有一明显界面。离心 5 分钟（500 转/分） ，此时死细胞及碎片降至CPW+22%蔗糖溶液内，聚集在离心管底部，而活细胞由于有大量泡沫，故漂浮在上下界面处（洗液与漂浮纯化液之间） 。用吸管轻轻插入离心管底部，将沉在离心管底部的碎片连同蔗糖溶液一起小心吸出，再吸去上清液即得到健康的原生质体。或用吸管小心地将原生质体带吸出，转入到另一刻度离心管中
