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1、综述反相高效液相色谱保留机理 流动相的二次化学平衡作用殷芬 （ 上海医科 大学卫生分 析化 学教研室）使用 化学键合有机固 定相的反相高 效液相色 谱 RP H P L C ） 已成为液相色 谱中 最重 要的方法， 在 所 有要进行分离 分析的化合 物中 ，有三 分之二可 用 R P HP L C来 完成 1 - 4 。 反相液相 色谱最初 是用来分离非极 性和非离子 型化 合物的。 随着 研究的不断 深入， 实践证明 ，将 流 动相的组分 进行 调节， 往水溶性流 动相中加入适 当的缓冲液或有机改性剂，即控制流动相的二 次化学平衡，能使大多数极性和离子性化合物在反 相色 谱中 获得成功的分离
2、 5 - 9 。 调节 流动相， 以保持或 改 变 溶质的 浓度或存 在的 形式，因 而控制溶 质在流 动 相和固定相 之间 的 分配。目 前大多 数研究 工作都 是涉 及到离子平衡 （ 如溶质的离 子化控 制和 形成离 子 对）。 此外， 除对保留 和选择性进行控 制外，还 可靠抑 制干扰竞争 平衡或副 反应来改善 峰形， 图1 表明了中 性和离子 化合物 在反相柱上的保 留范围。一、缓冲液的使用及离子抑制大量实验结果证实，对弱酸、弱碱这些在 水溶 性溶 液中 易发 生离 子化的样品 进行分离时， 最简便 的方法 就是用缓冲液来 调节 流动 相的p H值 1 0 , 1 1 , 亦即 对离
3、子化过程 进行抑制， 所以 此方法被称为 “ 离 子抑制”( l o n S u p p r e s s ) ， 且离 子抑制最有效 的范围 是在p H3 8 5 。 T w i t c h e t t 和M o f f a t 1 2 在B o n d a p a k C1 柱 上 用甲 醇和各 种不同P H值的磷 酸缓冲 液混合 组成 流动相。选择了三十种有代表性的强酸、弱酸、中性和碱性药物进行分析。其实验结果证实，流动相 的p H值以 及化合物本身 的p K a 值 对保 留性 质有很 大影响， 并认为化合物 在 O D S 反相柱 系统中 的 分 配 主要取决 于三个物理 化学性质：
4、1 化合物以 非离子 （ 化） 形式存在的比例 （ 即流 动相p H值及 化合物p K a 的函 数）。 2 化合物的 非离子 （ 化）形式 在固 定相和 流 动相中的 相对脂溶性 （ 即 化合物在水和 有机溶剂间的分配系数）。 3 . 流动相中甲 醇的比 例。 正如 所料， 化合物的 非离子化 形式 易 分配进 入固定相。因此，当化合物的p Ka 和分配 系 数 已 知 时， 可对其 色谱性质 进行 推测。 此外，缓冲盐的种类对化合物的保 留也 有 影响。有实验发现 1 3 ，在流动相中用派嗪或磷 酸四亚甲基二胺代替磷酸钠作缓冲液时。同样是将流动 相p H调至6 ， 而被分离物 的保留 性质
5、有明显改 变，峰形改善。 P o p l 等 1 4 也进行了这方面的研究，用 甲醇: 水（ 7 0 : 3 0 ） 的流动相，缓冲 液浓度和 P H 值保 持不变，用醋酸 铵代替磷酸二氢钠 时，生物碱的 保 留 因子减 小。 这 说明， 除有维持溶 液p H 值的 作用 外，缓冲液还有多种作用，这些还有待于进一步探讨研究。 由 于O D S 柱的 化学 不稳定性，在p H 1 .5 8 范围之外，固定相会发生降解，所以对 p Ka 小于 2 或 大于7 的 化合物 就不 适宜 用缓冲液来抑 制离子化。 但近 年来HP L C 迅速发展，使 用化学性质更为惰 性的大孔聚合 物 （ 苯 乙烯 二
6、 乙烯苯）固定 相 1 5 - 1 7 ，使得流 动相使用的P H范围达到1 1 3 ,因而离子选择性的优点也可用于强酸和 强 碱 的分 离， 这方面已 有报道 1 8 。关于离子抑制的机理还未确切了解，目前认为有两个主要原因 5 ，第一，认为流动相中的 缓 冲 液与被分析 样品相互反应， 使得样品的离 子平衡向 “ 中性”形式移动，这就易于在反相柱上进行色谱分配。例如，根据下列平衡存在的离子化合物： R C O O H+ H2 O R C O O - + H O +非 离 子离子用缓冲 液调节色 谱系统的p H， 提供 更多的质子 而 促 使平衡向左 移动。当 P H值低于某 弱酸的P K
7、a 时， 则其保留 时间就长 （ 抑制了离 子化）， 反之，当 p H 值高于 P K S 时 ，洗脱就快；碱 性 样品正 好相反。 P H 值高于 P K a ， 保留 时间 则长 P H值低于 p K a ， 洗脱 就快。之所以样品的离子形式比中性形式洗脱较快是 因为离子形式更易溶于水溶性流动相。 上 述机理 是离 子化的控 制。 第二 种解释 是缓冲调节剂使得表面残留硅醇基与样品的相互作用减到 最小，这是因为缓冲调节剂能 “ 复盖”这些硅醇基 团，阻止 其吸附样 品分子和参与 离子样品的保留 。 尤其 是磷酸 盐缓冲 液，其 作用机理可能就属于后 者。 如有作者 1 9 在分离 碱类药物
8、时 ，在流动相中 添 加K H2 P O 4 缓冲 盐后， 样品保留 时间缩短，似 乎 证明了 此点。 且有时在相同离子 强度下，使 用不同 盐类的缓冲 液会出现 不同 的峰 形， 也可用 这一 “ 残余硅醇作用”解释。二、离子对色谱离子对技术在很多情况下可代替离子交换用于分离离子化合物。此方法现已能够对大 量 化 合 物（ 包括生物胺、药物及其代谢物、染料、羧酸等） 进 行有效分离 2 0 - 2 4 。 现代离子 对液 体色 谱可归为 几 类： 1 正相离 子对分配色 谱， 将会有离 子对试剂 的 水溶液 涂布 在硅胶上，用 有机溶剂流动 相洗脱化 合物；2 反相离子对分配色 谱， 固定相
9、 为非极性表面 （ 如C 8 或C 1 8 ），分离酸时在水溶性流动相 中 加 入有机 碱 （ 如磷酸四丁铵）， 分离碱时可 加入 有机 酸 （ 如辛基磺酸）。 因 为用离 子交换法分离中性和离 子样品时 并非 都令 人满意， 而用离子抑制法 分离离 子化 合物也有困难，所以 反相离子对色谱已广泛用于分离带不同电 荷的化合物。离子对色谱的保留机理一直难以确定。目前有 三种假设，其中的两种提出了较极端的情形，而且 各自 都包罗了数量可观 的色 谱数 据，它 们 分别是离 子对 模式和动 力学离 子交换 模式，第 三种观点则是 离子相互作用机理。离子对机理强调，被分离化合物与流动相中的相反离子形成
10、离子对，然后这一不带电荷的离子对 分配 进入亲脂性固 定相中 2 5 - 2 7 ， 用方程 式描述此过程： R aq + + C a q - R C a q R C rg图2 为离子对机理的示意图。RGl o o r 等 2 8 ，经理论推导认为，被分离 化 合物的保留是由离子对的结合力K I P 及 相反离子的浓度 决定的，离子 对越易溶于亲脂 性固 定相，流 动相中 相反离子浓度越高，则保留时间越长。然而有些实 验结 果 2 2 都表明， 对于某些相反离 子，超过一 定 浓度，则保留 时间反而会 减小。 离子交换机理 2 9 , 3 0 ，是假设不成对 的 相 反离子吸附在非极性固 定相
11、表面，其离子 基团 在表面 定向排列 （ 见图3 ）， 使柱子 产生离子 交换 柱的效果。离子对试剂的链越长，则在 “ 离子交换器”的 表面复 盖得越多，因 而保留时间 也越 长。最近，B id l i n g m e y e r 等 3 1 , 3 2 提出了离 子相 互作用机理。 他们在实验中将一系列中性和带电 荷 的样品注射到含 有带正、负电荷亲脂 化合物的流 动 相系统中 去，无论是离子 对还 是离子交 换机理都不 能圆 满地解释所得到的结 果， 而用离子相互 作用机 理来解释也许 更为恰当。 此机 理无须 假设 在任何 一 相形成离子对， 而是 认为由于 亲脂离子 的动力学 平 衡导
12、致表面形成了电 子双电 层，样品的保留 是来自 由 离子 对试剂 提供的 表面电荷强 度所产生的 静电 力 以 及对非极性表面的附加吸附 作用。 关于离子 对现象确 切机理的争论 还在继续，问 题在于 大量的 实验资料得出了 矛盾的结论。然 而实 验必须有理论指导，因此， 建立模式的重要 性在于 了 解和控制 色谱保留的 各个因素，并 有助于 发展快速而合理的分离方法。 由 于离 子对方法 被证 实对极性 化合物 有很 好的 选 择性， 所以 对药物及其在生物体 系中常 遇到的 一 些 化合物的 分析极为有用，尤其在氨基酸、 核酸、 肽 及蛋白 质的 分析方面是很 有潜力的 3 3 - 3 7
13、 。三、有机胺类调节剂大量色谱实践证实 3 8 - 4 4 ， 在用键合反相色谱 分离 各种疏水铵、含氮 化合物、 肽、 蛋白 质及各种 碱 性物质时， 常有拖尾现象发 生， 峰形不对称， 而 往流动相中 加入烷基胺或 其他铵类化合物时，就能 使 峰形大为改观。 Ho r v a t h 及其同事们 4 5 , 4 6 ，首先提出 了反相键 合固 定相上的 双保留 机理。 他们 认为， 样品的保 留 并不象 有些作者认为那 样仅 仅是憎溶作用， 而 且 还存在着被测物与固 定相表 面上的残留 硅烷醇基 之间的 相互作用， 尤其是在含水较少的 水一有机溶 剂 流动相中 ，硅烷醇基更易与样品发生反
14、应， 在流动相中加入胺类或铵类化合物，其作用是将硅醇基 掩盖， 使其不能与 样品 发生作用 4 7 - 5 0 。 这些加 入 的碱往往 被称之为竞争（ c o m p e t i t i v e ） 碱，因为它们 与样品的碱性基团发生竞争，吸附在 硅醇基上。 值 得注意的是， 所加入的竞争碱中 有一 定 的浓 度范 围，低于或超过此范围峰 形都得不 到改善， 这说明残留硅烷醇基的吸附能力是有限的。参考文献1B . L . Ka r g e r ,R . W. Gi e s e , A n a l .C h e m . , 5 0 , 1 0 4 8 A ( 1 9 7 8 ) . 2C .H
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