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1、!“ 卷 # 期 !“$ 年 # 月生物工程学报 !“#$%+?$*+$ !.%/“.721?7218-6$)9)99$9)$9$99*9)6,-721!7218-6$)9)99$9)$9$)*9)6,-7217218-6$)9)99$9)$9$*$*9)6,-721A7218-6$)9)99$9)$9$9)$9)6,-721B7218-6$)9)99$9)$9$9)6,-721C7218-6$)9)99$9)$9$9)9)6,-721=7218-6$)9)99$9)$9$*$99)6,-721D7218-6$)9)99$9)$9$9$9)6,-721E7218-6$)9)99$9)$9$*)
2、$9)6,-721F7218-6$)9)99$9)$9$)$9)6,-721G7218-6$)9)99$9)$9$999)6,-721H7218-6$)9)99$9)$9$*$9)6,-721I7218-6$)9)99$9)$9$)*9)6,-721J7218-6$)9)99$9)$9$*9)6,-72137218-6$)9)99$9)$9$*$9)6,-721K7218-6$)9)99$9)$9$9*9)6,-721L7218-6$)9)99$9)$9$)*)9)6,-721M7218-6$)9)99$9)$9$9*)9)6,-721N7218-6$)9)99$9)$9$)9$9)6,-F8
3、47K8478-699)9$)$)$*$9*9)99$9)$6,-A84;K84;8-6)9$)$)$*$)9*99$9)$9$6,-A84;C84;8-699$)9$)$)$*$)$9)9$9)$9$6,-D84:K84:8-69$)$)$*$)9)99*9)$9$*6,-A844K8448-6$)$*$)9)99$9*9$*9)6,-D722K7228-6$)9)99$9)$9*$*9)6,-A720K7208-6)9)99$9)$9$*9*9)6,-!72,K72,8-6)99$9)$9$*9)9*)$)9)9)6,-!72,C72,8-69)$9)$)9)9)$*9)6,-表 8“#$
4、 “ 端缺失的引物:C50467278-6)*$*$9)*$9*)*$)9*)$)96,-17:C5,467278-6)*$*$99$*$)*99*$*$9*)6,-18:C55467278-6)*$*$9)*99*)9*)9*)6,-15:C58467278-6)*$*$9$)9)9)$6,-!9:重组表达载体的构建!9:9!3K0 3 端和 C 端缺失片段基因的获得： 以质粒 #EO6E;6K0 （图 1） 为模板， 根据表 1 和表 , 所列引物， 其中 3 端缺失的 8-端引物均与 LKN! 引物配对、C 端缺失的 ,-端引物与 LKB! 引物配对， 进行 !CN 扩增。!CN 条件为
5、： 45P预变性 8/%+； 45P变性 82? =AB68A+*-C3D+00C3 高效液相色谱仪） 纯化。定点突变 为半胱氨酸的多肽， 复性纯化后的二硫键偶联二聚体、 疏水相互作用二聚体与单体进一步采用全胶洗脱法进行分离纯化： 蛋白经 +*E制备型 “F“G3H$%（FIIGJJJ*KH 型， 北京市六一仪器厂） 分离， 转移到全胶洗脱仪上 （5L=M8? 公司） ， *-.H 恒电流洗脱0).L9， 反向 *-.H 恒电流电泳 +);， 收集分离组分。图 *%* 重组蛋白的疏水性分析图NLOP*!Q6 Q:?R=SQ=TL1L6 =U %* 898:V6? T: FH“!HM ;=UL6
6、、 2=SSG=?; 和 %L;69T6RO 三种算法进行 分析。分析时平均氨基酸残基长度常数采用默认值： #:L6 算法为 X 个残基， 2=SSG=?; 算法为 Y 个残基， %L;69T6RO 算法为 + 残基。!“含半胱氨酸 ( 的二聚体的二硫键化学交联 经全胶洗脱纯化的疏水相互作用二聚体和单体样品先对 35“ （S2 Y,K-） 透析， 再对 35“ （S2 Y,K-） D*.=D:;8;D /0/)123. +:?:A:?:A:?:A:061 ? “#$%+AB:“:57 :5069 （66+;57BD57 %(E )*)+,-.）（-）)*)+,-.； （F）859:5;6 :0
7、61 G0:4 A6D=6“= “6:06K“=59D56: 95;BA ? “6 “DB:5 45C“:0:09 C“:056:2!：80=7+:HC5，6 :061 ? “LM#+“#$N90:5+AB:“:57 :5069 （%(E )*)+,-.）（-）)*)+,-.； （F）859:5;6 :061 G0:4 A6D=6“= “6:06K“=59D56: 95;BA ? “6 “DB:5 45C“:0:09 C“+:056:左右， 可被沸水浴或尿素解聚 （图 #+-， “65 I） ； 其二为二硫键共价结合的同源二聚体， 分子量 #$O* 左右（相当于单体 (MO* 的 ( 倍） ，
8、 可被 *33 （二巯基苏糖醇） 还原解聚 （图 #+-， “65 M） 。6?;172 ? () AB;“7;“#$%.,AB;“;68 ;? 6176 6FB“1J172LM B186 F?7O“67; F?A=17“;1?7； （M“76N， K， #:5?H ;56 ;56 26 6B;6CJ68 “2“17:; /*PL/*/，H51F5 H668 ?68 ?LM +44；DT： () 81“CJ68 “2“17:; /*PL/*/（.）*+*,-./(； （U）96:;6?;172 H1;5 A?7?F?7“ “7;1=?8C S6?;172 H1;5 F?7O“6:F67; :6
9、#DDTTE!“!二聚体形成天然中和表位所需的环境氨基酸!“!“#() 重组蛋白的 端缺失： () 的 端缺 失得到重组 蛋 白 D$N ! ?%A%B$ CDEAA9$: EF *,A%BG9$#DABH$I#A% *+等$#用冰冻蚀刻电镜技术对昆虫细胞表达的类病毒颗粒的结构进行研究， 结果提示戊肝病毒 678-衣壳蛋白首先形成同源二聚体， 0 对同源二聚体进而形成六聚体的子粒结构， 并逐渐组装形成病毒衣壳。我们在进一步寻找原核表达的 678- 衣壳蛋白组装成颗粒的相互作用区域时， 初步发现组装成类病毒颗粒 （:?)） 所需的区段， 与本研究发现的同源聚合核心区域是相互独立的， 不能形成二聚
10、体的多肽 （1 端位于 !“#$ 以前或 *:*:?* 疏水区突变成强亲水性氨基酸） ， 包含有颗粒组装区段， 亦可形成:?)， 但仍丧失了依赖于二聚体的主要天然中和表 位， 从而为颗粒性重组 9,: 疫苗的研究提供更充分的理论依据 （结果另文报道） 。本研究将 %,- 蛋白的 !4/2* 定点突变成为半胱氨酸进行自交联反应， 大大简化了已有的化学交联和氨基酸定位过程$， 而且形成二硫键的键长比偶联剂的分子长度更短， 较为有力地说明发生交联的氨基酸在空间位置上的接近。!“#$? 和 !“#0)突变成为半胱氨酸不能发生交联， 说明所处的位置在空间位置上不够靠近， 提示 !4/2* 是 %,- 单
11、体相互作用界面上较为接近的位置。从蛋白质构象对交联反应的影响来考虑， 半胱氨酸的亲水性较弱 （亲水性指数为 $4A$2 BC DEF $） 不会破坏疏水相互作用二聚体的形成， 在一定的氧化条件下疏水二聚体的半胱氨酸可发生键合共价交联， 而未聚合的单体分子却不能发生交联， 说明 %,- 聚体 （而不是未形成天然中和表位的单体） 上的 !4/2 在空间位置的接近， 初步证明 !4/2 所处区域 （*:*:?*） 是疏水相互作用的直接作用结构域。然而， 疏水二聚体一旦发生共价偶联， 则丧失了主要的天然中和免疫表位， 提示疏水相互作用结构域具有一定的柔性。综上所述， 相互作用结构域是 %,- 发生疏水
12、聚合的重要元件， 促使主要天然中和免疫表位构象的形成， 聚合的%,- 可能具有较普通重组蛋白更好的免疫原性， 从 而具有作为 9,: 疫苗的良好前景。!“#“!“$%“,%$%4 ?6?4,86 01 4#6 #6?$4,4,: A,2B: :42B74B2$5 ?2046,%. % 08,6: 40 4#6 #6?$4,4,: A,2B:. -.)/!0! %,1*/#$ ,2 ()*,$,34（病毒学报） ，CDDH，#$ （H） ： CEM G CCH N O$8L,7P$ Q，R0516%86% O. /03?$2,%B4,0% /0611,7,6%4: U64=66% 4#6 V$?
13、02 S#$:6，/$%6，E9W74$%05 $%8 (6B42$5 QXB60B: -05B4,0%. 5),+ 6.!7)0“*4，EYZZ，%,%$%4 #6?$4,4,: 7$?:,8 ?2046,%:6519$:63;56: ,%40 $ 8B$59803$,% _ E ?$24,756 ?26:6%4,%56 26$,%68 =,4# 8,11626%4,$5 3$: :?674209 3642,7 ?6?4,86 3$?,%/67416#“),/ 2,* -!$ 5),$,34 #/ :17,* -!$ /3)/!*)/3，?)#7!/ /)A!*0)“4，?)#7!/HNEDDF， -.)/#）?7+-/0+*6?$4,4,: ,: $ 3$,% 7$B:6 01 $7B46 A,2$5 #6?$4,4,: ,% 86A650?,%,9 050B4 4#6 12$4,0% S5$% 01 4#6),%,:42： ZN9FYC9CEZ!EED； 93$,5： %:,$fa,%&,$%.3B.68B.7%ZY生物工程学报CD 卷
