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1、分子生物学与临床中 山 大 学主讲：杨 中 汉 （）目 录PCR的概念 PCR技术的创建 PCR的原理 PCR的反应体系和方法 PCR的类型和应用多聚酶链式反应多聚酶链式反应（PCRPCR：Polymerase Chain Reaction)Polymerase Chain Reaction)Polymerase:Polymerase: DNADNA聚合酶聚合酶基因组基因组DNADNA引物引物 DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA片段体外扩增片段体外扩增PCRPCR技术的创建技术的创建KaryKary B. Mullis B. Mullis（穆利斯（美）穆利斯（美）Khorana(1971)K
2、horana(1971)等提出在体外经等提出在体外经DNADNA变性变性, ,与适当引与适当引 物杂交物杂交, ,再用再用DNADNA聚合酶延伸聚合酶延伸, ,克隆克隆DNADNA的设想。的设想。 19831983年年, ,MullisMullis发明了发明了PCRPCR技术技术, ,使使KhoranaKhorana的设想得的设想得 到实现。到实现。19881988年年SaikiSaiki等将耐热等将耐热DNADNA聚合酶（聚合酶（TaqTaq）引入了引入了 PCRPCR技术技术 19891989年美国年美国ScienceScience杂志列杂志列PCR PCR 为十余项重大为十余项重大 科学
3、发明之首科学发明之首, ,比喻比喻19891989年为年为PCRPCR爆炸年爆炸年, ,MullisMullis荣荣 获获19931993年度诺贝尔化学奖。年度诺贝尔化学奖。KaryKary B. Mullis B. Mullis（19441944）http:/三篇重要论文The Unusual Origin of the Polymerase Chain The Unusual Origin of the Polymerase Chain Reaction (Scientific American, 1990,262(4):56-Reaction (Scientific American,
4、1990,262(4):56- 61, 64-5 )61, 64-5 )Primer-directed Enzymatic Amplification of DNA Primer-directed Enzymatic Amplification of DNA with a with a ThermostableThermostable DNA Polymerase DNA Polymerase (Science,1988,239(4839):487-91(Science,1988,239(4839):487-91 ) ) Specific Synthesis of DNA In Vitro v
5、ia a Specific Synthesis of DNA In Vitro via a Polymerase Catalyzed Chain Reaction (Methods Polymerase Catalyzed Chain Reaction (Methods in in EnzymologyEnzymology, 1987,155:335-50 ), 1987,155:335-50 )生物样品生物样品DNADNA片段片段基因诊断基因诊断基因治疗基因治疗基因工程产品基因工程产品法医学检测法医学检测人类学研究人类学研究PCR技术诞生所依赖的社会需求和研究需要基因组基因组DNADNA获取
6、特定获取特定DNADNA片段片段扩增特定扩增特定DNADNA片段片段限制性内切酶裂解限制性内切酶裂解基因组基因组DNADNA基因重组基因重组转化细菌转化细菌体外包装体外包装基因组基因组DNADNA文库文库DNADNA文库文库20kB fragments插入噬菌体载体细菌扩增裂解裂解 变性变性显影显影从基因组文库中筛选目的基因probeDNADNA克隆克隆目的基因目的基因载体载体复制子复制子宿主细胞宿主细胞扩增扩增扩增扩增提取提取DNADNA分子分子DNADNA聚合酶聚合酶引物引物引物引物M13M13噬菌体噬菌体SangerSanger的的 测序技术测序技术引物DNADNA聚合酶聚合酶1977年
7、引物引物MullisMullis 的构思的构思DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA聚合酶聚合酶特定特定DNADNA片段片段1983年9494变性变性50-6550-65退火退火XX延伸延伸949455553737TaqTaq DNADNA聚合酶（聚合酶（thermusthermus aquaticusaquaticus) )酶酶活性活性(%)(%)温度温度()40 50 60 70 80 90 10010080604020727294945555PCRPCR循环循环PCRPCR技术的原理技术的原理1 1 PCRPCR技术的基本原理技术的基本原理无细胞分子克隆法：在微量离心管中无细胞分子克隆法：
8、在微量离心管中, ,加入加入 适量的缓冲液适量的缓冲液, , 微量的模板微量的模板DNA,DNA,四种脱氧单四种脱氧单 核苷酸核苷酸, ,耐热性多聚酶耐热性多聚酶, , 一对合成一对合成DNADNA的引物的引物, , 通过通过高温变性高温变性、低温退火低温退火和和中温延伸中温延伸三个阶三个阶 段为一个循环段为一个循环, ,每一次循环使特异区段的基因每一次循环使特异区段的基因 拷贝数放大一倍拷贝数放大一倍, ,一般样品是经过一般样品是经过3030次循环次循环, , 最终最终使基因放大了数百万倍使基因放大了数百万倍; ; 扩增了特异区扩增了特异区 段的段的DNADNA带带。 体内体内DNADNA的
9、复制的复制DNADNA聚合酶聚合酶dNTdNTP P解旋酶类解旋酶类 引物引物复习复习5 533加热加热变变 性性复复 性性复 温DNADNA的变性和复性的变性和复性加热或强酸、碱性作用加热或强酸、碱性作用 可以使可以使 DNADNA双螺旋的氢双螺旋的氢 键断裂键断裂, ,双链解离双链解离, ,形成形成 单链单链DNA,DNA,这称为这称为 DNADNA的的 变性。变性。解除变性的条件后解除变性的条件后, , 变变 性的单链可以重新结合性的单链可以重新结合 起来起来, ,形成双链形成双链, ,其原有其原有 的特性和活性可以恢复的特性和活性可以恢复, , 这称这称DNADNA复性复性, , 也叫
10、退火也叫退火 。 PCRPCR扩增原理扩增原理引物引物延伸延伸延伸延伸5 55 53 33 3变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火2 2 PCRPCR技术的特点技术的特点1 1 ）高度的灵敏性）高度的灵敏性3030轮循环轮循环扩增量达扩增量达2 23030个拷贝（个拷贝（10109 9拷贝拷贝 ）PCRPCR产物每轮循环增加一倍产物每轮循环增加一倍2 2 ）特异性）特异性 引物引物引物引物引物的序列及其与模板结合的特异性是决引物的序列及其与模板结合的特异性是决 定定PCRPCR反应结果的关键。反应结果的关键。引物设计的最大原则是最大限度地提高扩引物设计的最大原则是最大限度地提高扩 增效率和
11、特异性；同时尽可能减少非特异性增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性 扩增。扩增。引物设计：引物设计：（1)1)序列应位于高度保守区序列应位于高度保守区, ,与非扩增区无同与非扩增区无同 源序列。源序列。（2 2）引物长度以）引物长度以15-40 15-40 bpbp为宜。为宜。（3 3）碱基尽可能随机分布碱基尽可能随机分布, ,G+CG+C占占50-60%50-60%。（4 4）引物内部避免形成二级结构。）引物内部避免形成二级结构。（5 5）两引物间避免有互补序列。）两引物间避免有互补序列。（6 6）引物）引物33端端为为关键碱基关键碱基；55端端无严格限无严格限 制。制。3355355限制
12、性内切酶的识别序列限制性内切酶的识别序列启动子序列启动子序列定点突变定点突变探针标记探针标记3 3）操作简便易行）操作简便易行PCRPCR扩增法扩增法, ,只需要数小时只需要数小时, ,就可以用电泳就可以用电泳 法检出法检出1 1gg基因组基因组DNADNA中仅含数个拷贝的模板中仅含数个拷贝的模板 序列。序列。通常的通常的DNA DNA 扩增法是分子克隆法扩增法是分子克隆法, , 首先要首先要 构建含有目的的基因的载体构建含有目的的基因的载体, , 然后将它导入然后将它导入 细胞后进行扩增细胞后进行扩增, ,还要用同位索探针进行筛选还要用同位索探针进行筛选 ; ;这种方法这种方法, ,要经过要
13、经过DNADNA内切、连接、转化和培内切、连接、转化和培 养等相关的过程养等相关的过程, ,操作复杂操作复杂, ,一般需要数周时一般需要数周时 间。间。目的基因目的基因载体载体复制子复制子宿主细胞宿主细胞扩增扩增扩增扩增提取提取DNADNA分子分子4 4 ）用途广泛）用途广泛生命学科生命学科医学工程医学工程遗传工程遗传工程疾病诊断疾病诊断法医学法医学考古学考古学PCRPCR的反应体系和方法的反应体系和方法PCR管加热使模板变性, 退火使引物与模板DNA互 补,延伸需将反应温度升至中温( 72),在Tap多 聚酶的作用下,以dNTP为原料,以引物为复制的起 点,合成新链。如此重复改变反应温度,即
14、高温变性、低温退火 和中温延伸三个阶段为一个循环,每一次循环使特 异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30 次循环,最终使基因放大了数百万倍; 将扩增产物 进行电泳,经溴化乙锭染色,在紫外灯照射下肉眼 能见到扩增特异区段的DNA带。总体积总体积 50-100 50-100 l lBuffer Buffer 缓冲液缓冲液dNTPdNTP 原料原料Primer Primer 引物引物DNADNA分子分子 模板模板 TaqTaq酶酶 DNADNA聚合酶聚合酶 1 1 反应体系反应体系PCRPCR技术的基本过程技术的基本过程(1)(1)模板模板DNA DNA dNTPdNTP 引物引物Buffe
15、rBuffer预变性预变性模板模板DNA DNA dNTPdNTP 引物引物BufferBufferTaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶9494o oC5C52 2 基本过程基本过程PCRPCR技术的基本过程技术的基本过程(2)(2)Taq Taq 酶酶模板模板DNA DNA dNTPdNTP 引物引物BufferBuffer循循 环环 仪仪949455 55 72 72 Taq Taq 酶酶模板模板DNA DNA dNTPdNTP 引物引物BufferBuffer72 72 5 57 7 minmin琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳PCRPCR技术的基本过程技术的基本过程(3)(3)1 1）PCRPCR反应成分反应成分（1 1）模板模板单、双链单、双链DNADNA均可。均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、不能混有蛋白酶、核酸酶、DNADNA聚合酶抑制聚合酶抑
