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1、研究 LncRNA 的一种新方法-RNAscope 技术我们对 RNA 的理解在过去几十年里不断得到发展，RNA 不仅仅只承担遗传信息中间载体的辅助性角色，而是更多地承担了各种调控功能。ncRNA 在发育和基因表达中发挥的复杂精确的调控功能极大地解释了基因组复杂性之难题。对 ncRNA 的研究主要的手段是对细胞或组织提取的 RNA 进行定量和定性的分析，常用的方法包括定量 PCR，芯片，测序，northern blot 等。为了获得ncRNA 在细胞及组织中的表达信息，对细胞或组织直接进行 RNA 检测也是非常必要的，这就需要用到原位杂交的方法。原位杂交的方法可以提供目标 RNA 在单个细胞内
2、的空间定位，以及结合组织形态学显示在组织中不同类型细胞表达RNA 的精确信息。传统 RNA 原位杂交选择放射性标记、荧光标记或生物素标记的 RNA 探针，存在特异性差、灵敏性差的缺点，因此在 ncRNA 研究中的应用受到了很多的限制。RNAscope 是基于独特的探针设计和信号放大方法的原位杂交方法。它采用类似于荧光共振能量转移(FRET) 的探针设计策略, 两个独立的探针( 双 Z 探针) 必须串联杂交到目标序列才能引起信号放大发生，结合在非特异性位点的单个Z 探针不会产生一个完整的信号放大分子结合位点，从而防止非特异性信号的放大，显著提高了检测的特异性（见图 1）。每个 RNA 分子只需三
3、对双 Z RNA 探针结合到目标 RNA 就可以检测到信号，该方法的高灵敏性使 RNAscope 平台具有原位检测人类转录组中大多数基因的能力，很多低丰度的 RNA 也可以清晰的显示空间位置。RNAscope 双 Z 探针的设计方法要求检测的 RAN 长度要求至少300 碱基以上，因此，这个方法已经被广泛用于长链非编码 RNA（LncRNAs）的研究。目前 LncRNA 在肿瘤、干细胞、发育等领域的研究都非常火热。以干细胞为例，探讨一下 RNAscope 技术在 LnRNA 研究中的应用。目前研究已经发现了数十种功能性的 lncRNA，在干细胞命运决定，x 染色体沉默、基因印记、剂量补偿效应、
4、调控蛋白活性、RNA 剪切等生命活动中发挥着极广泛的调控作用，并参与到一些重要疾病的发生发展过程中。在 LnRNA 的机制研究中，首先我们需要确定 LnRNA 在细胞内的定位，以初步预测 LnRNA 的可能功能。要进行细胞定位，一种方法是通过细胞核和细胞浆的 RNA 提取和定量分析，初步推断 LnRNA 在细胞内的分布。接下来就该 RNAscope 上场了。原位杂交清晰显示 LnRNA 的细胞定位及定量情况，为 LnRNA 的细胞定位提供了最为直接的证据。在细胞水平LnRNA 机制研究结束后，就到了体内验证的阶段了。LnRNA 没有蛋白产物，因此要在体内检测 LnRNA 的表达情况，高灵敏度高
5、特异性的 RNAscope 原位杂交的方法就是最佳选择了。下面以加州大学洛杉矶分校再生医学和干细胞伊莱和伊迪特-布罗德中心(Eli and Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research at UCLA)Lim DA 团队最新在 cell stem cell 上发表的文章，为我们实例演示一下 RNAscope 在 LnRNA 研究中的应用25800779。为了研究长链非编码 RNA Pnky 在神经干细胞的神经元分化中的调节作用，利用 RNAscope技术，非常清晰的显示长链非编码 RNA Pnky 在培养的神经干细胞主要表达在细胞核中。进一步体内小鼠脑切片中应用 RNAscope 原位杂交技术显示 Pnky 主要在冠状脑区特异性表达。这为下一步研究 Pnky 对神经干细胞分化调节提供了重要的线索。AB 图 2 The lncRNA Pinky Is Expressed in V-SVZ NSCs and Regulates Neuronal Differentiation。有关 RNAscope 应用于研究 LncRNA 的文章已经在近两年不断发表，我们总结了这些文章的研究内容，并在 ACD 网站上与大家共享（http:/
