抗人淋巴细胞再循环受体单克隆

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1、 l 一6 。 岳 【l r14 病 刚 删 c h in e e j 。 u r n a I 。 f P a c h 0 p h y i0 1。 g y l。 ： L ) 抗人淋 巴细胞再循环受体单克隆 抗体的制备与鉴定 北泉中医药大学微生物学教研室 (北京1 0 0 0 2 9) 邱 全琏 - D e p t o f Pa t h o l o gy ，St a t e Un i v e r s i t y o f Ne w Yo r k f ； 7 2 一 ； c 。 。 B 。 。 y ， N w Y 。 k 】 。 。 u s A M i c hl JKHe r c r HM 摘要用人

2、外周血高纯度 的 淋 巴 细 胞 做 抗 原，通过杂交瘤技术 ，获得一鼠抗人单克 隆抗体 Me Ab)- QM5( I g Gl 。K 轻 链 )。Me Ab QMS O 特异 地 与9 8 的淋 巴细 胞 5 9 的单 接 细胞 和 0 左右 的胸 腺 细胞 反应 ， 而不 与红 细胞、 血小 板 和多 棱 白细胞 反应 ，与 OKT a和 OKT B抗 豫亦 不 相黄 。 Mc Ab Q M5 尤其能特异地阻断人淋巴细 胞与 周围稀 巴结 内毛细血管后静脉内皮细胞结合，蛆断作 用与 剂 量 相关 ，3 0 # g的 Mc Ab QM5可完 全 抑制 其结合 。 定量 分 析 Me Ab Q

3、M 5的结 合特性 ，证 明每一 淋 巴 细胞 表 面 能结合 大 约1 2 l 0 个 Mc Ab QM5分 予 。用 W e s t e r n b l o t分 析 ，Me Ab QM5能与 淋 巴细胞 蛋 白 溶解产 物 中一种 多脓 成分 结 合 ，其 分子 量 为 l 3 5 3 Kd(还 原 条 件 下 为 l 4 8 3 Kd)。 凼 此 ， Mc Ab QM5 可 用 于鉴 定新 的淋 巴细 胞再 循环 受体 。 一 主 曩伺淋巴细胞j毛细血 管内皮I杂交瘤 f 抗体单克隆 ， 一 一 淋巴细胞再宿 环 ( 1 y mp h o c y t e h o mi n g ， 材料

4、与方法 LH)是指血流中的淋 巴 细胞 ，通过淋 巴结或 淋巴组织中毛细血管 后微 静 脉的 高内皮 细胞 ( h i g h e n d o t h e l i a l v e n u ，HE V)、入 胸 导 管，又回到血循环。其生理学 意义在 于可进 一 步扩 大免 疫反应 。因此引起人们极大 的研究 基 趣 。学者们 认为 LH的首要条件是 淋 巴细胞 凿 识别HE V，而且 已证 明了淋 巴细胞膜 上存在着 淋 巴细胞 再循 环受 体( h o mi n g r e c e p t o r HR) ， 它 能 识 别 存 在 于 HEV 上 的 相 应 配 体 ( a d d r e

5、 s s i n)，进而穿过H E V 间隙，进 行 再 循 环 。为 了 研究 和发 现 HR，常规 的方法 是以淋巴细胞作抗原，制备出能抑制淋巴细胞 一HEV 结台 的单克 隆 抗体 ( Mc Ab)，再以此 Me Ab去 分 析 鉴 定 淋 巴 细 胞上 的 HR。 W o o d r u f f 等指 出 可 用 小 鼠或大 鼠的淋 巴结 为 模型来研究人 的LH。我们在研究人 的HR中 筛 选出一株能分 泌H R的Mc Ab 杂交 瘤，并对 此 Me Ab 进 行 r鉴定，现报告如下 。 一、抗人 t t R Mc Ab的 制 备 ：用 P y t o + ws k i 方法 。以健

6、康 人高纯度 的外周血淋 巴细 胞 (P B L，纯度 9 8 ，活细胞 9 8 )1 0 1 0 细胞 0 5 ml 经腹腔免 疫B AL B C雌 鼠， 2 周 后 ，用经副醛杀 死 的P BL 再次 免疫 。以后用 死及活各半的P B L 加强免疫 2次。试 采血 ，用 间接免疫荧光法 ( 亲和层析纯化的 F i r e羊抗 鼠I g G ( n b ) ：( 购 自美 国 C o o p e r B i o me d i c a l -C a p p e l 公 司 )和 固 相 微 量放射免疫法 测 血清中 抗 P B L抗 体水平I同时 用 S t a m e r W o o d

7、r u f f淋 巴细胞 - HEV结合抑制试验 测 此抗体的抑制活性，选择其中具有高度抑制活 性 的小 鼠，于末 次免疫 后 3天 ，按常规取其脾 细胞与 P 3 X6 3 一 AG8 U1(P 3 u一 1)骨 髓瘤 细胞 (为 Mi c h l J教授 实验 室保 存细胞株 )融台 ， 并培养杂交瘤细胞 。用 固相放射免疫 法，分别 以纯化人 P B L、单 核细胞、多核白细胞 、啕腺 细胞 和 I g G 作抗原，检查杂交 瘤 所 分泌的抗 转载http:/体 的特 异州， ，同时测细胞培养液 中抑制 淋巴细 胞- HE V结 合的 抗体 水平 ，最后筛 选 出仅能分 泌抗淋 巴细胞

8、，尤其能抑 制 淋 巴细胞一 HE V结 合的抗人 HR Me Ab的杂 交 瘤，用有 限稀 释 法 进 行 再 克 隆，再重复上述检查法 。将此杂 交瘤接种 入经降植烷预 处理的 BAL B C 鼠腹 腔 、以诱生 高浓度Mc Ab 的腹水 。 二、S t a mp e r Wo o d r u f f淋 巴 细胞 - HEV 结合试验 和结合抑制试验 取 志 愿 健康人 (小鼠或大 鼠 )新鲜 淋 巴结，连 续做厚 8 p m的 冰冻切片 ， 3 戊二醛 一 P B S固定后 ，放 水平 旋转仪上，将人单个核细胞悬液在R P MI - 1 6 4 0 (美国 Gi B C O 公司 )一3

9、 胎 牛 血清 (美 国 F l o w L a b o r a t o i e s I n c 一 )培 养 液中 ( p H7 2 7 4)，细胞浓 度为 31 0 细 胞 ml ，每切片 加2 O 0 1 ，置 7冷室 中旋转 3 0 rai n( 8 0 r p m) ， 洗下 未结 台的单个 核 细 胞 后 ，再 固定至少 2 O mi n，用硫堇 甲 绿 染 色 ，HE Y 被染为 蓝紫 色， 单个核细胞为绿色 光镜下计数每一切片中 结台丁 2( 或 6) 个以上淋巴 细胞 的总 HE V 阳性数 每 一试 验用 3 4张切片 ，以is 表 示 。 。 淋 巴细胞- HE V结合抑

10、 制试验 ，首先 用杂 交瘤上清液或 Mc A b与 P B L悬液 在3 7 孵育 3 0 ra i n ，离心虢去未结合的抗体，再如 上傲淋 巴细胞一 HE Y结合试验 ，按下列 公式计算抑制 百分 率 抑 制 = ， 经抗体处理后的P B L HE V用i 皇 墼、 、 系弪抗 处理的P B L H E V阳性数， i 0 0 三、固相微量放射免疫试验( s R I A) 用9 6 孔 T e r a s a k i U形板 ( 美 国 R o b b i n s S e i e n t if i c C o r p )，分别加入P B L 、单核细胞、多 核 白细胞 、胸 腺细 胞 (

11、4 51 0 细胞 m1 ) 以及 I g G(0 l mg m1 )1 O l 孔 ，然后相 继加 入杂交瘤上清液或 Me A b和 I 一羊抗鼠 I g G ( F a b ) ： ( 美 国 Ame r s h a m C o r p )，最 后加 入 1 N Na O H 1 0 1 孔，取细胞溶解物用Y 计 数 器测放射性 ，以三复孔i s 表示。 四M 山的类及亚类鉴定；按常规用兔 -6 O5 抗 鼠 I g的类 ，亚类 及 和 轻链抗 血清 ( 美 国 S i g m a C h e mi c a l C o )，对 杂 交瘤上清或 Mc Ab 做琼 脂双 扩散，鉴定其 类别 。

12、 五 、Mc Ab的纯化 及分 子量测 定 。 ”：用 蛋 白G亲 和 层 析 柱 (P r o t e i n G s e p h a r o s e 4 F a s t F l o w 瑞 典、 P h a r ma e i a L KB)，从腹 水 中 直 接 纯 化 Mc Ab ，纯 度分 别用抗小 鼠 I g类血 清做琼脂双 扩散 ，并 同 时用 P h a s t Ge l S DS P AGE ( 瑞 典 P h a r ma c i a L KB)电 泳检 查 。采 用 “C标记 标准分子量蛋白厦溶液 (美 国Ame r s h a n C o r p ， ) 与Mc Ab 同

13、 时进行 S DS P AGE电泳 测定Mc Ab 的分 子量( 分离胶 8 、 浓缩胶 3 5 ( 美国 B i o - P a d 公司 )，4 5 m A 电泳4 5 mi ff 。 六 、Me Ab的 I标记及鉴 定 l用 I o d o b e a d s法 (美 国 Pi e r c e公 司 标 记 ” I Me Ab ，经 S DS - P AGE电泳 和放射 自显影检查 标记 效果 。 七、Mc Ab在淋巴细 胞上结合点 的定量测 定 纯化的活淋巴细 膻 (51 0 细 胞 )与 不同浓度的 ” I - Mc A b和未标 记的该Me A b 结 合，测其特异性结台的放射性，

14、并甩E n z f i t t e r 程序对资料按非线性回归分析，再计算每个淋 巴细胞上大约存在的Mc Ab 子的结合点。 八 、We s t e r n - b l o t ” ”纯化 细胞 的溶解物 (21 0 细胞 )及“ C 标准分子 量蛋白溶液， 经 S D S P AG E电泳后，转移到礴陵纤维膜上 (1 0 0 V， 1 h)，与” I - Mc Ab(21 0 。 p m m1 )以及 与比其大 5 0 倍 量 以上 的非标记 Sc Ab 反应，经放射 自显影测定与 I - Me A b 反应的 细胞成分厦其分子量。 结 果 、Me A b Q M5 杂交瘤细胞株的筛选：用

15、人P B L 免疫小 鼠脾 细胞 与P 3 1 _J _ l 骨髓 瘤细胞融 合，能分泌抗体的杂交瘤为4 3 ，用S - R I A和 淋巴细胞一 HE V 结合抑 制试验，筛选出一株 鼠 抗人淋巴细胞H R的Me Ab ， 命名为 Me A b Q M5 。 二 、Me Ab QM5的纯化及 类别 和分 子量测 定 杂 交瘤腹 水 经 蛋 白。亲和层析柱纯化、 S D $ ： P A G E 泳，获得一分子量为1 0 K 啪 多 中国科技论文在线http:/6 0 6 互 量 曼n。 ! 1 乞 n g f I - QM 5 F i g B i n d i n g c h a r a c t e r i l t i c s o f Mc Ab QM5 Fr e s h l y pu r i f i e d hu ma n PBL(51 0 0 2 m1)we r e i n c ub a t ed i n c e wi t h i n c r e a s i n g a