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1、研 究 报 告荧光相关光谱单分子检测系统的研究张普敦1, 2任吉存32(上海交通大学化学化工学院1,环境科学与工程学院2,上海200240)摘 要 基于激光共焦构型,构建了一套高灵敏度和高稳定性的荧光相关光谱单分子检测系统。采用高数值孔径物镜使激光束高度聚焦,并用同一物镜收集样品的荧光,单光子计数器用于实时记录荧光信号。优化系统保持物镜焦点、 针孔以及单光子计数器光敏区高度同轴。采用601. 2 (NA)的水浸物镜及直径为160m的针孔得到的检测系统结构参数为 0和z0分别为0. 42m和1. 33m,照射微区的体积为1. 3 fL。单个Rhodamine Green分子可获得13倍的信噪比。
2、用该系统获得了小分子和生物大分子(DNA片段和蛋白质)的高质量荧光相关图谱,成功实现了单个分子的检测。关键词 荧光相关光谱,单分子检测,分子扩散2004208222收稿; 2004201217接受 本文系国家自然科学基金(No. 20271033)、 国家自然科学基金重点项目(No. 20335020, 90408014)、 上海市自然科学基金(No.02ZA4057)以及中国博士后科学基金资助项目1 引 言单分子检测( single molecule detection, S MD)达到分子探测的极限,是人们长期以来追求的目标。 与传统的分析方法相比,单分子检测法研究体系处于非平衡状态下的个
3、体行为,或平衡状态下的波动行 为,因此特别适合研究化学及生化反应动力学、 生物分子的相互作用、 结构与功能信息、 重大疾病早期诊 断、 病理研究以及高通量药物筛选等。激光诱导荧光检测技术由于具有无可比拟的灵敏度而成为单分子检测的首选手段。荧光相关光谱(fluorescence correlation spectroscopy, FCS)是一种新兴的单分子检测 技术,通过测定溶液中微区内(10- 15L)发光粒子因布朗运动或化学反应而产生的荧光涨落现象,分析 荧光涨落的相关函数而获得单个粒子(如分子)的浓度、 化学动力学参数等信息。其概念于上世纪70年代提出1,但直到90年代中期才得到快速发展2
4、 。目前荧光相关光谱单分子检测技术正深入到多个领域,特别是一些重大疾病3, 4 和活细胞内生物分子5, 6 的研究中。本实验自组装了一套荧光相关光谱单分子检测系统,讨论了各种影响检测灵敏度的因素,并对系统 进行了优化。将其应用于一些荧光小分子和生物大分子的研究中,均取得满意的结果。2 理论分析荧光相关光谱的工作原理已在文献7 中作了详细讨论。物质的荧光强度与其浓度(即荧光分子 数)成正比。在照射微区内由于布朗运动或化学反应使进入或离开微区的分子数目总是在其平衡值处 发生变化,从而产生荧光涨落现象,它是时间的函数F ( t)。微区内的荧光分子数在任一时间t的变化 导致荧光强度的涨落值为 F (
5、t) ,它反映了分子在微区内的运动轨迹。用归一化自相关函数 (normalized autocorrelation function)G ()可将荧光的涨落与迟延时间相关:G()= F ( t)F ( t +) F ( t)2(1)符号 代表时间平均值,F ( t)表示在任一时间t时的荧光涨落,F ( t+)代表经迟延时间t后的荧光 涨落。方程(1)经一系列数学推导后转换为:G()=1 N1 (1+/D)11+ (0/z0)2 /D(2)第33卷2005年7月分析化学(FENXIHUAXUE) 研究报告Chinese Journal ofAnalytical Chemistry第7期89990
6、3其中N为照射微区内分子数,D为荧光分子的特征扩散时间常数,0和z0分别为微区的径向和轴向半 径。式(2)即FCS的基本公式,它包含了丰富的单分子动力学和热力学方面的信息。3 实验部分3. 1 实验装置及光学系统 自组装荧光相关光谱装置如图1所示。混合气体离子激光器(美国Melles Griot公司)产生的激光(ex=488 nm)经衰减、 扩束后穿过激发滤光片(485DF22,美国Omega Optical公司)照射到双色镜(505DRLP,美国Omega Optical公司) ,经双色镜反射进入荧光倒置显微镜( I X71,日本Olympus公司)的物镜(UplanApo 601. 2,日
7、本Olympus公司) ,聚焦于盖玻片上的样品溶液。产生的荧光经同一物镜 收集后发散为平行光,穿过双色镜并经发射滤光片(530DF30,美国Omega Optical公司)滤光后聚焦于 针孔(pinhole,本装置目前采用160m直径的针孔,该针孔与单光子计数器的光敏区贴合在一起)。然 后进入单光子计数器(雪崩二极管APD, SPCM2AQR216,加拿大Perkin2Elmer公司)。APD产生的信号经 关联器(ALV25000 /EPP,德国ALV2GmbH公司)关联,从计算机输出。3. 2 试剂Rhodamine GreenT M、 荧光素(美国Molecular Probe公司)以及羊
8、抗人IgG2FITC (华美生物工程公司)均配成0. 1 mmol/L的储备液,然后按要求稀释到相应浓度; Rhodamine Green溶液、IgG2FITC溶液以及SYBR2Green I(美国Molecular Probe公司)的二甲亚砜溶液(1 /100)均保存于- 20 的冰箱中。所有溶 液均用18. 2 Mcm的超纯水(美国Millipore公司)配制。3. 3 盖玻片硅烷化处理 当FCS装置用于生物大分子的分析时,为了防止盖玻片表面硅羟基吸附对测定的影响,将新的洗 干净的盖玻片用1 mol/L HCl浸泡数小时,使其表面尽可能完全地硅羟基化。然后用水冲洗,晾干。硅 烷化试剂32m
9、ethacryloxypropyltri methoxysilan(美国Sigma公司)配在50% (V /V)的醋酸溶液中,浓度为4%6% (V /V)。将盖玻片逐片放入该溶液中,溶液完全浸没盖玻片,轻轻晃动,然后密封,于室温下放 置过夜,取出,依次用乙醇和水冲洗干净,晾干即可使用。3. 4 PCR反应 用Q I Aamp试剂盒从人的全血中提取基因组DNA为PCR模板。PCR混合母液中含有10mol/LTris2HCl, pH 9. 0, 1. 5mol/L MgCl2, 0. 2mol/L的两种引物, 125mol/L的4种脱氧核苷酸dNTP,5L模板DNA (300 ng)以及1U Ta
10、q酶。PCR在DNA热循环仪(美国Applied Biosystems公司)上完 成。PCR程序为: (1) 94下变性4 min;(2) 35个PCR循环(9440 s, 5830 s, 7240 s) ,31727 min。两种引物序列分别为5 2AGGACGGTGCGG2TGAGAGTG23 和5 2TGAAGGAGAAGGT2GTCTGCGGGA23,由其限定的PCR产物链长为198 bp,来自于人的四甲基叶酸还原酶基因。毛细管电 泳分析表明PCR产物产率高,纯度好,不用纯化即可直接用于荧光相关光谱的研究中。3. 5 实验过程 荧光相关光谱的实验过程非常简单。激光打开后稳定30 min
11、,调节中性衰减片至所需的光强,调节光路使得到最强的信号,硅烷化盖玻片置于滴有纯水的显微镜物镜上,在盖玻片上滴加20L的待测样 品,然后进行信号采集。根据样品的不同,采样时间30180 s不等。4 结果与讨论4. 1 FCS系统的建立在荧光相关光谱单分子检测装置中(图1) , 2片滤光片分别除去激发光和荧光中的杂散光。双色 镜是一种半反半透镜,用于将激发光完全反射,使之进入显微镜物镜;同时将收集的荧光完全透过,使之 到达检测器。产生的荧光经物镜收集后变为平行光,因此在进入检测器前必须用透镜再聚焦。针孔用 于空间滤波( space filter) ,以滤去来自非焦点区的荧光。 荧光相关光谱单分子检
12、测成败的关键在于从大的背景噪音中提取单个分子的信号。在激光荧光检009 分 析 化 学第33卷测法中背景噪音主要来源于喇曼和瑞利散射、 样品溶液、 盖玻片固有荧光以及检测器暗电流。其中喇曼 噪音由于可以与单分子荧光信号重叠而影响最大。因此降低背景噪音是荧光相关光谱首先要解决的问 题。Weiss指出8 有效降低背景噪音的方法: (1)尽量减小激发区体积,因为单分子信号与激发体积无图1 自组装FCS装置示意图Fig . 1 Schematic diagram of the home2builtfluorescence correlation spectroscopy ( FCS)setup关,而背
13、景噪音与激发体积成正比; (2)采用高效光学收集元 件; (3)采用低暗电流检测器; (4)采用其它手段有效消除背景 荧光。 本实验中调节光学系统,确保进入物镜后孔的光束严格 位于后孔的中央。为了保证荧光能得到有效收集,本系统采用601. 2 (NA)的水浸物镜。另外,为了得到小的激发微 区,进入物镜的激光束一般需要扩束以充满物镜的后孔。本 装置采用两个凸透镜(图1中透镜1和透镜2)实现了激光束 的扩束。改变透镜2的焦距可以改变扩束的倍数。 针孔的大小决定照射体积。孔径大,照射体积大,信号强,但噪音也增大;反之,光损失又增大。针孔直径在20250 m范围内都是可行的。本系统采用160m的大针孔
14、主要是为了调节的方便,更小的针孔同样可用于本检测系统。另外本装置将针孔与检测器光敏感区紧密贴合,避免了采用光纤时引起的光损失,也能使灵敏度得以提高。由于FCS装置采用高倍率高数值孔径的物镜,入射光束被高度聚焦,如果不经衰减直接照射到样品,高的能量会迅速导致荧光漂白,使实验失败。本系统采用的激光束经衰减后的激光强度为38 kW /cm2,这样的能量密度基本可以保证实验的稳定进行。所有的荧光相关光谱谱图必须经过数学拟合才能获得有用的数据。在数据处理过程中,要仔细识别APD检测器的Afterpulsing效应9、 分子转动扩散10 、 分子聚集11 以及三线态分子12等引起的相关信号,并从总自相关光
15、谱中将其剔除,以获得正确的信息。4. 2 仪器结构参数测定 用已精确测得扩散系数的小分子(如Rhodamine、Rhodamine 6G、 荧光素等)来测定仪器的结构参数。为了与激发波长匹配,本实验采用Rhodamine Green测定,其扩散系数为2. 810- 6cm2/s。数据采集时间为30180 s,得到的实验点用MicroCal Origin 6. 0拟合,拟合方程为公式(2)。7次测定平均值为 0=0142m和z0=1. 33m,RSD分别为0. 54%和1. 7% (n=7)。由此得到照射微区的体积为1. 3 fL。4. 3 系统有效性测试为了验证系统是否正确工作,根据Maiti
16、等的建议13 ,设计了以下两组实验对系统进行测试: (1)配制一系列不同浓度的Rhodamine Green溶液(1. 010- 10mol/L, 2. 010- 10mol/L, 5. 010- 10mol/L,10. 010- 10mol/L) ,分别对其进行FCS测试,从而得到不同浓度下照射微区内的分子数N。如果系统正确工作,N应该与浓度呈线性关系。图2 (a)给出实际测得的结果,其分子数与浓度的相关函数为y=6.944x+0. 679,相关系数为0. 994; (2)根据Stockes2Einstein公式:D =kT 6 R(3)式中D为扩散系数, k为Boltzman常数,为溶液粘度, R是粒子半径。对甘油水溶液而言,当甘油浓度较低时,溶液粘度与浓度近似线性关系。因此实验中将1. 010- 10mol/L Rhodamine Green配在
