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1、1丹酚酸抗氧化活性及其对 DNA 损伤保护作用作者：柳艳，李磊，刘王莹，陈茂勇，吴倩【关键词】 丹酚酸；抗氧化；DNA 损伤；化学发光摘要： 目的 探讨丹酚酸抗氧化活性及其对 DNA氧化损伤的保护作用机制。方法 运用自由基反应模型观察丹酚酸对二苯代苦味酰肼自由基(DPPH)和羟自由基的淬灭效应，使用邻菲罗啉(Phen)-CuSO4-VC-H2O2-DNA化学发光体系测定丹酚酸对 DNA损伤的抑制作用。高效液相色谱(HPLC）测定丹酚酸的组成。结果 丹酚酸水提物(AE)、乙酸乙酯萃取物(EE)、大孔吸附树脂纯化物（ RE)和对照维生素(VC)、二丁基羟基甲苯(BHT)对 DPPH自由基的半数清除
2、浓度(IC50)分别为 1412，153，146，158 和 715g/ml。化学发光体系中，丹酚酸的加入能明显抑制并延迟 DNA损伤。AE、EE、RE 抑制发光 50浓度(IC50)值分别为12936，620，492g/ml。丹酚酸清除 DPPH自由基能力和对羟自由基攻击的 DNA损伤保护作用受丹酚酸组成和丹酚酸 B含量的影响。结论 丹酚酸属于预防型和断链型抗氧化剂，并可有效清除DPPH和羟自由基，对 DNA损伤有明显保护作用。丹酚酸的抗氧化活性及对 DNA损伤的保护作用与丹酚酸 B含量有关。2关键词： 丹酚酸；抗氧化；DNA 损伤；化学发光Antioxidant activiy and p
3、rotection effect of salvianolic acids on DNA damage Abstract： Objective To study on the antioxidant activity of salvianolic acids and mechanisms of its protection against DNA antioxidative damage.Methods Free radical model was employed to investigate the scavenging activity to 1，1-diphenyl-2-picryl-
4、hydrazyl(DPPH) and hydroxyl free radicals.The mechanisms of the effects of salvianolic acids on protection against DNA damage was measured by chemiluminescence on the reaction system of phenanthroline (Phen)-CuSO4-VC-H2O2-DNA.Salvianolic acids composition in samples were determined according to HPLC
5、 analysis.Results The hemi-inhibitable concentration(IC50) of crude aqueous extract(AE)，ethylacetate extract(EE)，resin extract(RE)，ascorbate(VC) and butylated hydroxytoluene(BHT) to DPPH free radicals were 141.2，15.3，14.6， 15.8 and 71.5g/ml.Three extracts could obviously inhibit and delay DNA damage
6、 caused by hydroxyl free radicals.The IC50 valvue of chemiluminescence of AE，EE 3and RE were 1293.6，62.0，and 49.2g/ml.The scavenging activity and protective effects against DNA damage were effected by salvianolic acids composition and salvianolic acid B level.Conclusion Salvianic acids can effective
7、ly scavenge DPPH and hydroxvl free radicals，protect against DNA damage which belongs to preventive and chain-breaking antioxidants，and the effects are related to salvianolic acid B level.Key words： salvianolic acid；antioxidant；DNA damage；chemiluminescence丹参是我国防治心脑血管病的传统药物，对冠心病、高血压、糖尿病肾病及癌症等疗效确切。近 20
8、多年来的药效研究表明，丹酚酸是丹参活血化瘀作用的主要功能成分1 。自由基参与机体多种疾病的发生和发展过程，清除自由基、提高机体抗氧化能力，是许多药物防治慢性疾病的重要途径2 ，3 。从化学结构上分析，丹酚酸类化合物是酚羟基的供体，具有抗氧化活性的结构基础。本文研究了丹酚酸对二苯代苦味酰肼自由基(DPPH）的清除效应，并探讨其对体外 DNA氧化损伤的保护作用及可能机制，为进一步研究丹酚酸药理作用提供科学依据。41 材料与方法11 仪器及色谱条件 LC-10A高效液相色谱仪(日本岛津公司)；DU600紫外-可见分光光度计 (美国 Backman公司)；Orion II高灵敏度板式化学发光检测仪(德
9、国 Berthold Detection Systems公司)。Alltima C18(150mm46mm，5m)色谱柱；流动相为水 (05冰醋酸)(A)- 乙腈(B)；梯度条件：030min 时525 ,3060min 时 2530B ；流速 10ml/min；柱温为室温；检测波长 280nm；进样量 20l。12 试剂 丹酚酸 B对照品(中国药品生物制品检定所，批号111562-200403);二苯代苦味酰肼自由基 (DPPH)、DNA 、维生素C(VC)(美国 Sigma公司)；二丁基羟基甲苯 (BHT)(上海凌峰化学试剂有限公司)；实验用水为超纯水(182M)，其余试剂为分析纯。不同含
10、量和组成的丹酚酸水提取物(AE)、乙酸乙酯萃取物(EE)、大孔吸附树脂纯化物(RE)(本实验室自制)。13 方法131 DPPH自由基清除法 参照文献4 。反应体积为3ml，取 05m1不同浓度的样品加入 610-5mol/L的 DPPH乙醇溶液中，混匀后室温下测定 DPPH反应液在 517nm处的吸光度。5BHT、VC 作对照比较。样品对 DPPH的清除率()=A0-A 样)/A0100%。A0 为 DPPH对照在时间 t=0时的吸光度值，A 样为加有样品的 DPPH t=30min时的吸光度值。132 清除羟自由基及对 DNA损伤的保护作用 参照文献5 。采用邻菲罗啉(Phen)-CuSO
11、4-VC-DNA 体系检测清除羟自由基及对 DNA损伤的保护作用。用 01mol/L醋酸盐缓冲液(pH55) 配制 Phen-CuSO4-VC-DNA溶液，使 Phen、Cu2+、VC 和 DNA的最终浓度分别为 3510-3mol/L、1510-4mol/L,2810-3mol/L、150g/ml。加入一定量的样品(对照用缓冲液补齐)。取该溶液 1ml，放入发光仪样品池中，加入 200l 30的 H2O2溶液，混匀，启动发光反应，连续测定发光强度(CL)。发光强度抑制率( )=(CL 对照-CL 样品)/CL 对照100。2 结果21 丹酚酸清除 DPPH自由基的能力 在本实验条件下，DPP
12、H浓度在 560mol/L 范围内与 517nm下的吸光度有良好线性关系，Y=00104X+00051(R2=09999)。不同的丹酚酸在各浓度下对 DPPH自由基均有清除作用，其清除能力与浓度在一定范围内呈量效关系。AE 、EE、RE、VC、BHT 对 DPPH自由基的半数清除浓度(IC50)分别为 1412，153，146，158，715g/ml 。其中，丹6酚酸 EE、RE 和丹酚酸 B在 525g/ml 范围内随着浓度的增大，清除 DPPH能力呈线性增加。当样品浓度进一步增大到 50g/ml后，其清除能力增加趋于平稳，清除反应的量效关系与 VC相似。在 5200g/ml 浓度范围内 ,
13、AE清除 DPPH的浓度效应呈线性关系，浓度为 200g/ml时，AE 清除 DPPH的能力达到 710，接近于同浓度下 BHT的水平。实验观察了不同样品在浓度为25g/ml时对 DPPH自由清除能力的动力学变化(30min) 。AE、EE、RE 在 30min内吸收值均不断下降，超过 30min后仍有下降趋势。而对照 AsA在反应启动后，能快速清除 DPPH自由基(610-5mol/L)，并达到平衡。22 对羟自由基损伤 DNA的保护作用 Phen-CuSO4-VC-H2O2-DNA化学发光体系中，Phen 在金属离子的催化下与 H2O2作用，生成羟自由基，产生最大发射在 445450nm
14、范围内的化学发光。羟自由基引起 DNA损伤，能产生一延迟于 Phen本身氧化发光信号的慢化学发光。最大发光波长范围在 380420nm。丹酚酸混合物 AE、EE 和 RE均能有效防止羟自由基引起的 DNA损伤。当 AE终浓度分别为 200，500，1000，2000g/ml 时，DNA 损伤产物发光峰延迟时间分别为 180，240 ，400，1220s ；发光抑制率分别为 1374，2664，4650 ，6893 。EE 终浓度为25，50，160，200，400g/ml 时，DNA 损伤产物发光峰延迟时间分别为 320，420 ， 520，940，1980s；发光抑制率分别为72713，56
15、17，7152，7696，9067。RE 终浓度为25，50，100，150，200g/ml 时，DNA 损伤产物发光峰延迟时间分别为 340，400 ， 800，960，1040s；发光抑制率分别为3824，4863，6326，7649。丹酚酸的加入能使 DNA损伤产物发光峰较空白对照组有明显下降，且有明显后移现象，浓度越大，作用越强。AE、EE 、RE 的抑制发光 50的浓度(IC50) 分别为 12936，620,492g/ml。浓度为 200g/ml时，丹酚酸AE、EE、RE 的延迟时间大小顺序为 REEEAE。可见，丹酚酸对 DNA氧化损伤的保护能力大小依次为 REEEAE。23 丹
16、酚酸组成对抗氧化能力的影响231 丹酚酸组份测定 外标法测丹酚酸 B标准品在不同浓度下所得的峰面积，以浓度和对应峰面积建立线性回归方程，Y=15197X+92802(r2=09998)。测得丹酚酸样品 AE、EE 、RE 中丹酚酸 B的纯度分别为 56，744，905。AE、EE 、RE 中除丹酚酸 B(保留时间为 28465010min)外，还存在 5个共有峰，保留时间(min)分别为20748005；22498006,24032007，25265008，32698020。分析各峰面积可知(AE、EE、RE 浓度均为 2mg/ml)，AE 各峰面积均明显低于 EE、 RE，显示 AE中总丹酚酸含量低于 EE和RE。RE 中峰 2,3,6的面积分别是 EE的 112,655,387倍，而峰 4,5的面积则低于 EE，分别为 EE峰面积的 69
