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1、酶联免疫吸附实验（ELISA）基本原理 1971 年 Engvall 和 Perlmann 发表了酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）用于 IgG 定量测定的文章，使得 1966 年开始用于抗原定位 的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。这一方法的基本原理是：使抗 原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。使抗原或抗体与某种酶连接成 酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时， 把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的 抗原或抗体起反应。用
2、洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开， 最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后， 底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反 应的深浅刊物定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从 而使测定方法达到很高的敏感度。 方法类型和操作步骤 ELISA 可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有 3 种必要的试剂： 固相的抗原或抗体，酶标记的抗原或抗体，酶作用的底物。根据试剂的来源和标本 的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。 （一）双抗体夹心法 双抗体
3、夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：（1）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。（2）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上 的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。（3）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶 标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。（4）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行 该抗原的定性或定量。根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹 心法测定标本中的抗体。 （二）双
4、位点一步法在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗 体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作 一步（图 15-5） 。这种双位点一步不但简化了操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力的 单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显著提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的 ELISA 提高到新水平。 在一步法测定中，应注意钩状效应（hookeffect） ，类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。 当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成 夹心复合物，所得结果将低于实际含量。钩状效应严重时甚至可出现假阴性结
5、果。 （三）间接法测抗体 间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合 的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下： （1）将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原：洗涤除去未结合的抗原及杂质。（2）加稀释的受检血清：其中的特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经 洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体。其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。（3）加酶标抗抗体：与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标记上酶。洗 涤后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。例如欲测人对某种疾病的抗体，可用酶 标羊抗人 IgG 抗体。（4）加底物
6、显色：颜色深度代表标本中受检抗体的量。 本法只要更换不同的固相抗原，可以用一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体。 （四）竞争法竞争法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，受检抗原和酶标抗原 竞争与固相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比。操作步骤如 下：（1）将特异抗体与固相载体连接，形成固相抗体。洗涤。（2）待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的混合溶液，使之与固相抗体反应。如受 检标本中无抗原，则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。如受检标本中含有抗原，则与酶 标抗原以同样的机会与固相抗体结合，竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会， 使酶标抗原与固相载体的
7、结合量减少。参考管中只加酶标抗原，保温后，酶标抗原与固相 抗体的结合可达最充分的量。洗涤。（3）加底物显色：参考管中由于结合的酶标抗原最多，故颜色最深。参考管颜色深度 与待测管颜色深度之差，代表受检标本抗原的量。待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量 越多。 （五）捕获法测 IgM 抗体血清中针对某些抗原的特异性 IgM 常和特异性 IgG 同时存在，后者会干扰 IgM 抗体的 测定。因此测定 IgM 抗本多用捕获法，先将所有血清 IgM（包括异性 IgM 和非特异性 IgM）固定在固相上，在去除 IgG 后再测定特异性 IgM。操作步骤如下：（1）将抗人 IgM 抗体连接在固相载体上，形成固相抗
8、人 IgM。洗涤。（2）加入稀释的血清标本：保温反应后血清中的 IgM 抗体被固相抗体捕获。洗涤除 去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分。（3）加入特异性抗原试剂：它只与固相上的特异性 IgM 结合。洗涤。（4）加入针对特异性的酶标抗体：使之与结合在固相上的抗原反应结合。洗涤。（5）加底物显色：如有颜色显示，则表示血清标本中的特异性 IgM 抗体存在，是为 阳性反应。 （六）应用亲和素和生物素的 ELISA亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量 60kD，每个分子由 4 个亚基组成，可 以和 4 个生物素分子亲密结合。现在使用更多的是从链霉菌中提取的链霉和素 （strepavidin） 。生
9、物素（biotin）又称维生素 H，分子量 244.31，存在于蛋黄中。用化学方 法制成的衍生物，生物素羟基琥珀亚胺酯（biotin-hydroxysuccinimide，BNHS）可与蛋白 质、糖类和酶等多种类型的大小分子形成生物素化的产物。亲和素与生物素的结合，虽不 属免疫反应，但特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定。由于 1 个亲和素分子有 4 个生物素分子的结合位置，可以连接更多的生物素化的分子，形成一种类似晶格的复合 体。因此把亲和素和生物素与 ELIS 偶联起来，就可大提高 ELISA 的敏感度。亲和素生物素系统在 ELISA 中的应用有多种形式，可用于间接包被，亦可用于终反 应放大。可以在固相上先预包被亲和素，原用吸附法包被固相的抗体或抗原与生物素结合， 通过亲和素生物素反应而使生物素化的抗体或抗在相化。这种包被法不仅可增加吸附的 抗体或抗原量，而且使其结合点充分暴露。另外，在常规 ELISA 中的酶标抗体也可用生物 素化的抗体替代，然后连接亲和素酶结合物，以放大反应信号。
