兰州人学顺I ：学位论文中文摘要第一部分：大鼠复发性溃疡性结肠炎模型的制备与葡萄籽原花青素的治疗作用及其机理的初步探讨目的：用三硝基苯磺酸( T N B S ) ．5 0 ％乙醇溶液二次致炎法建立大鼠复发结肠炎模型，观察葡萄籽原花青素( G S P E ) 对其治疗作用，并初步探讨其作用机理方法：雄性W i s t a r 大鼠分为6 组：正常对照组、急性结肠炎组、结肠炎自发性愈合组、复发性结肠炎模型对照组、复发性结肠炎模型加柳氮磺吡啶( S A S P )治疗组( S A S P 治疗组) 、复发性结肠炎模型加G S P E 治疗组( G S P E 治疗组) 大鼠直肠给予8 0 m g ／k gT N B S ．5 0 ％乙醇溶液建立U C 模型，观察1 4d 后，用3 0 m g ／k gT N B S - 5 0 ％乙醇溶液诱导复发性结肠炎用2 0 0m g ／k gG S P E 灌胃对其进行治疗，并以5 0 0m g ／k gS A S P 作为阳性对照，给药7d 后处死火鼠，取结肠标本评价炎症程度并检测各项指标，结肠炎症的评价指标包括大体形态与组织病理学变化、组织与血清中髓过氯化物酶( M P O ) 活力；生化法检测组织与血清中丙■醛( M D A ) 、谷胱甘肽( G S H ) 和一氧化氮( N O ) 含量、谷胱甘肽过氧化物酶( G S H ．P x ) 、超氧化物歧化酶( S O D ) 及诱导型一氧化氮合酶( i N O S )活力。
结果：①与l 卜常对照组、急性结肠炎组及结肠炎自发性愈合组比较，复发性结肠炎模型时照组人鼠结肠湿重指数明显升高( P 0 ．0 5 ) ⑧与正常对照组比较，模型对照组大鼠结肠组织中A P ．1 与N F —K B 含量显著升高( P 5 7 8 ，平均聚合度为4 ～1 1 按聚合度的大小，通常将二～四聚体称为低聚体( p r o c y a n i d o l i co l i g o m e r s ，简称O P C ) ，将五聚体以上的称为高聚体( p r o c y a n i d o l i cp o l y m e r s ，简称P P C ) 原花青素具有极强的抗氧化特性，一般存在于果实的皮及植物的木实部，其主要作用是保护植物中易氧化的成分早在卜世纪5 0 年代法国科学家就从松树皮中提取大量原仡青素，其提取物中可含8 5 ％的原花青素到上L 汁纪7 0 年代! l ! I J 发现葡萄籽是提取原花青素的更好资源，葡萄籽提取物中原花青素含量可高达9 5 ％作为原花青索的来源，葡萄籽原花青素( p r o a n t h o c y a n i d i n sf r o mg r a p es e e d s ，G S P E ) 得到了最为深入和广泛的关注，大量的实验研究证实，G S P E 具有极强的抗氧化及清除自由基的能力，其在体内的抗氧化活性为维生素C ( V C ) 的2 0倍、维生素E 的5 0 倍『2 0 】。
研究还证实【2 1 ．2 7 1 ，G S P E 能降低血管的硬度，起到保护血管的作用，对心血管疾病有较好的治疗效果；此外，它还有抗菌消炎、抗辐射、抗肿瘤的作用；在欧美等国家G S P E 享有“皮肽维牛素”、“【] 服化妆品”的美誉G S P E 作为一种新的、安全的、高效的自由基清除剂和抗氧化刑具有多种生物活性和药理作用，对人类健康有多方而的益处对G S P E 的丌发具有很大的市场潜力和经济效益，而G S P E 也将成为具有广阔发展自仃景的天然药物兰州人学坝I j 学位论文立题依据溃疡性结肠炎( u l c e r a t i v ec o l i t i s ，U C ) ，又称非特异性溃疡性结肠炎，是一种原因未明的直肠和结肠慢性炎性疾病I l 】病变主要位于结肠的粘膜层，且以溃疡为主，多累及直肠和远端结肠，也可遍及整个结肠近年来，随着人民生活水平的不断提高、饮食结构的变化、工作压力增大、生活节奏加快，U C 的发病率逐年提高该病与结肠痛的发病有关，且病程长、病变程度轻重各异，由于病因不明，临床上常表现为反复发作而治愈难度大，被世界卫生组织列为现代难治病之一现有治疗U C 的药物5 ．氨基水杨酸、糖皮质激素类和免疫抑制剂剐作用大，而币在研究中的，L 物治疗药物，如抗肿瘤坏夕E 冈子抗体、干扰素等在治疗过程中常产生抗药体，难以长期应用，还有部分病人对现有药物不产生应答，因而迫切需要研究新作用机制的药物，丌辟药物治疗U C 的新途径。
对溃疡性结肠炎( U C ) 进行实验研究的f j 订提基础是建立合理的动物模，弘目前U C 的造模方法众多‘2 8 4 3 1 ，其中采用2 , 4 ，6 ．三硝基苯磺酸( T N B S ) 诱导大鼠溃疡性结肠炎模型的方法操作简单、经济实用、重现性好、造模时问短、病变持续时I ’日J 较长，体现急性炎症向慢性转化的动态过程山于临床卜的U C 患者有缓解和复发交臀的特点，而T N B S 诱导的大鼠U C 有自发性愈合的特点，使其无法模拟人类U C 缓解．复发的特点考虑到人类结肠炎的复发町能与炎症的慢性化、对致病抗原的高敏状念、与致病抗原的再次接触以及肠粘膜屏障的持续破坏有关1 4 4 1 ，本实验拟采用2 , 4 ，6 ．三硝基苯磺酸( T N B S ) 乙醇溶液在大鼠U C缓解期再次致炎，反复用T N B S 使肠道致敏，使其形成与人类U C 十分相似的模型原花青素存在于多种植物中，具有极强的抗炎活性【4 5 4 8 】葡萄籽原花青素( G S P E ) 吸收代谢的特点使其可和结肠粘膜充分接触，从而具有天然结肠靶向的特征，有可能对溃疡性结肠炎有良好的治疗作用我们f j 仃期的研究已证明了G S P E 对乙酸及T N B S 诱导的急件期的U C 有明娃的治疗作用f 4 9 。
5 0 1 ，本实验采用’F N B S 二次致炎法制备大鼠U C 复发的模型，观察／f 、= 同剂量的G S P E 对复发性U C 的治疗作用并探讨其机制，为G S P E 治疗U C 提供更多的辉沦依据兰州人学硕l ：学位论文研究内容本实验采用三硝基苯磺酸／乙醇( T N B S ．5 0 ％乙醇) 二次致炎法建立大鼠复发性溃疡性结肠炎( U C ) 模把，即在U C 缓解期对大鼠再次致炎，诱导能够模拟人类溃疡性结肠炎缓解和复发交替这一典型过程的模型通过研究G S P E 灌胃给药对T N B S 诱导的大鼠复发性U C 病变愈合、对炎症组钔．v - f 、白细胞浸润、R O S 生成、N F ．t d 3 及M A P K 信号转导通路激活及其调控的影响，进一一步阐明G S P E 灌胃给药对复发性U C 的治疗作用及其机理，为用G S P E 治疗U C 提供理论依据，为U C 的药物治疗提供新的思路具体内容如下：1 、建立大鼠复发性结肠炎模型，探讨溃疡性结肠炎复发的可能机制，用2 0 0 m g ／k gG S P E 灌胃给药，通过测定大鼠结肠组织及j 仃L 清中氧化损伤及抗氧化能力的变化( G S H 和M D A 含黾、S O D 和G S H ．P x 活性) 、白细胞浸润程度( M P O活力) 及组织与血清中N O 含量和i N O S 活力，初步考察G S P E 对大鼠复发性溃疡性结肠炎的治疗作用及其机制。
2 、研究G S P E 灌胃给药对大鼠U C 的治疗作用的量效关系：建立大鼠复发性溃疡性结肠炎模型，用不同剂量的G S P E ( 1 0 0 ，2 0 0 和4 0 0m g ／k g ) 灌胃给药，用病王里图像分析技术，测定G S P E 对大鼠复发性结肠炎病理学改／叟的影响，观察G S P E 对大鼠复发性结肠炎病理损伤的保护作用和促进愈合的作用研究G S P E 灌胃给药治疗大鼠复发性结肠炎的作用机理：测定结肠组织及血清氧化损伤及抗氧化能力的变化、白细胞浸润程度及N O 含量和i N O S 活力、细胞内M A P K ( E R K 、J N K 、p 3 8 M A P K 、c ．J u n 、c ．F o s 、A P ．1 ) 及N F ．x B 信号转导通路的激活，与模型对照组比较，揭示G S P E 对上述复发性U C 炎症病理乍理过程的影响，综合分析其抗氧化作用与M A P K 及N F ．x B 信号转导通路及其他指标变化的关系，从而I 捌明其作用机理具体研究路线如下：兰州人学硕．I ：学位论文4兰州人学砍I j 学位论文第一部分大鼠复发性溃疡性结肠炎模型的制备与葡萄籽原花青素的治疗作用及其机理的初步探讨1 材料1 ．1 动物W i s t a r 大鼠，体重1 8 0 “ - 2 0 0g ，8 ，由} j ‘∥什中医学院提供。
许可证号：S C X K ( 甘) 2 0 0 4 —0 0 0 6 1 ．2 药物葡萄籽原花青素提取物( G S P E ) ：天津尖峰天然产物研究丌发有限公司，批号0 8 0 1 0 1 2 ．3 1 ；柳氮磺吡啶( S A S P ) ：上海信谊嘉华药业有限公司产品，批号0 8 1 0 1 3 1 ．3 药物的配制G S P E 溶液的配制：按2 0 0 m g ／k g 给药，用生理盐水配成浓度为2 ％的G S P E 溶液；S A S P 溶液的f l e g i J ．按5 0 0 m g ／k g 给药，用i l 三理盐水配成浓度为5 ％的S A S P 溶液1 ．4 试剂2 ，4 ，6 ．三硝基苯磺酸( 2 ，4 ，6 ．T r i n i t r o b e n z e n e s u l f o n i ca c i ds o l u t i o n ，T N B S )水溶液( S i g m a 公司，5 ％( w ／v ) ，货号P 2 2 9 7 —1 0 M L ，批号2 0 0 8 0 3 0 7 ) ；考马斯亮兰、髓过氧化物酶( M P O ) 、丙二醛( M D A ) 、超氧化物歧化酶( S O D ) 、谷胱甘肽( G S H ) 、谷胱甘肽过氧化物酶( G S H ．P x ) 及～氧化氮( N O ) 和诱导型一氧化氮合酶( i N O S ) 试剂命均购自南京建成生物I ：程研究所，批号2 0 0 9 0 3 2 0 ；无水乙醇( 天津市光复科技发展有限公司，批号2 0 0 8 0 3 2 7 ，分析纯) 。
1 ．5 主要仪器高速低温离心机( T G L ．1 6 G ．A ，上海安亭科学仪器厂制造) ；台式离心机( K A ．1 0 0 0 ，上海安亭科学仪器厂制造) ；电动玻璃匀浆机( D Y 一2 ，宁波新芝生物科技股份有限公司制造) ；可见分光光度汁( 7 2 2 S ，上海精密科学仪器有限公司制造) ；病理图像分析仪( C M I S A 8 ．0 型，北京航空航天大学) ；称结肠苇J | J 电子天平( 0 ．0 0 0 1 ～2 0 0g ，F A l 6 0 4 S ，上海天平仪器厂) ；称体重用电子天平( O ．1 - 6 0 0g ，S P S 2 0 0 1 F ，梅特勒一托利多常州称重设备系统有限公司) 2 方法实验分两部分：第一部分探索制备溃疡性结肠炎模型所需T N B S 的最佳剂兰州人学硕l ：学位论文量；第二部分采用二次致炎法建立复发性溃疡性结肠炎模型2 ．1最佳剂量的探索雄性W i s t a r 大鼠3 0 只，体重l8 0 - - - , 2 0 0g ，按体重随机分为3 组，分别为5 0m g ／k g 组( 1 0 只) 、6 5m g ／k g 组( 1 0 只) 、8 0m g ／k g组( 1 0 只) ，各组大鼠禁食不禁水4 8h ，记录体重，腹腔注射3 0m g ／k g 戊巴比妥钠麻醉【5 0 1 。
手提大鼠尾部，使大鼠倒立，将1 6 号灌胃针头轻揉插入大鼠结。