生物学-蛋白质和氨基酸

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1、第八章 蛋白质和氨基酸的测定 第一节 概述1. 蛋白质概况蛋白质是含氮的有机化合物，分子量很 大。主要由C、H、O、N、S五种元素组成。 某些蛋白质中还含有微量的 P、Cu、Fe、I 等 。在食品和生物材料中常包括蛋白质， 可能还包括有非蛋白质含氮的化合物，（如核 酸、含氮碳水化合物、生物碱等；含氮类脂、 卟啉和含氮的色素）。食品和其原料中蛋白质含量的测定，主要 （也是最常用的）用凯氏定氮法测定总氮量， 然后乘一个蛋白质换算系数。这里也包括非蛋 白的氮，所以只能称为粗蛋白的含量（但马铃 薯等非蛋白氮多的要单测）。蛋白质是生命的物质基础，人体 11%13%总热量来自蛋白质。无论动物、植 物都含有

2、蛋白质，只是含量及类型不同。蛋白质是食品的最重要质量指标，其含量 与分解产物直接影响食品的色、香、味。蛋白质的测定方法分两大类：一类是利用蛋白质的共性即含氮量、肽键和折 射率等测定蛋白质含量；另一类是利用蛋白质中的氨基酸残基、酸性和 碱性基因以及芳香基团等测定蛋白质含量。具体测定方法：凯氏定氮法最常用的，国内外应用普遍。双缩脲反应、染料结合反应、酚试剂法 国外： 红外分析仪氨基酸总量酸碱滴定法测定。各种氨基酸的分离与定量色谱技术 。 有多种氨基酸分析仪。第二节 蛋白质的定性测定一、蛋白质的一般显色反应电泳或纸层析之后用一些染料与蛋白质 结合并变色。书中列举了 5 种染料。二、复合蛋白质的显色反

3、应 （一）糖蛋白的显色（3种方法） （二）脂蛋白的显色（2种方法）第二节 蛋白质的定性测定一、蛋白质的一般显色反应 1. 氨基黑法2. 溴酚蓝法3. 考马斯亮蓝法4. 酸性品红法5. 氨基萘酚磺酸法第三节 蛋白质的定量测定一般说来，动物性食品的蛋白质含量 高于植物性食品。例如牛肉中蛋白质含量为 20.0%左右，猪肉 9.5%， 兔肉 21%， 鸡肉 20%， 牛乳 3.5%， 带鱼 18.0%， 大豆 40%，面粉 9.9%， 菠菜 2.4%， 黄瓜 1.0%，苹果 1.4% 测定食品中的蛋白质的含量，对于评 价食品的营养价值，合理开发利用食品资源、 提高产品质量、优化食品配方、指导经济核算

4、及生产过程控制均具有极其重要的意义。一些蛋白质的含氮量一般为 15% 17.6%，有的上下浮动 可以测出总氮 N一、凯氏定氮法由Kieldhl于1833年提出，现发展为常量 、微量、自动定氮仪法，半微量法及改良凯 氏法。书中只介绍前三种。= N6.25 = 蛋白质含量（一）常量凯氏定氮法1. 原理样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二 氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为 氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使 氨蒸出。 用H3BO3吸收后再以标准HCl溶液滴定。根据标准酸消耗量可以计算出蛋白质 的含量。 也可以用过量的标准H2SO4或标准 HCl溶液吸收后再以

5、标准NaOH滴定过量的酸。整个过程分三步：消化、蒸馏、吸收与滴定1. 消化 总 反应式：加硫酸钾 作为增温剂，提高溶液沸点，纯硫酸沸点 340，加入硫酸钾之后可以提高至400以上。也可加入硫酸钠，氯化钾等提高沸点，但效果不如硫酸钾。2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4 （NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O 一定要用浓硫酸（98%）加硫酸铜 作为催化剂。还可以作 消化终点指示剂（做蒸馏时碱性指示剂）。 还可以加氧化汞、汞（均有毒，价格贵）、 硒粉、二氧化钛。加氧化剂 如双氧水、次氯酸钾等加速有机 物氧化速度。仪器：要防止 爆沸。另外：介绍“ 自动回流消化 仪”2. 蒸馏

6、消化液 + 40% 氢氧化钠加热 蒸馏，放出氨 气。3. 吸收与滴定 用4%硼酸吸收，用盐酸标准溶液滴 定，指示剂用混合指示剂（甲基红溴甲基 酚绿混合指示剂）国标用亚甲基兰+甲基红。指示剂 红色 绿色 红色（酸） （碱） （酸）用过量的 H2SO4 或 HCl 标准溶液吸 收，再用 NaOH 标准溶液滴定过剩的酸液， 用甲基红指示剂。吸收滴定 操作方法：121页，其中讲“以奈氏试 剂”检查氨是否全部蒸完，以奈氏试剂Nessler试剂，K2（ HgI4） 检验NH4+离子，遇铵根， 离子析 出黄色或红棕色沉淀。 配制方法1、 3.5 g KI + 1.3 g HgCl2 溶于 70 毫升水。加3

7、0毫升4 mol/L氢氧化钠（或氢 氧化钾）溶液，必要时过滤，并存于玻璃瓶中 盖紧口。方法2、 溶解11.5 g HgI2 + KI 10 g于适量少 许水，后加水稀释至50 ml,静置后，取其澄清液 ，弃去沉淀，储存于棕色瓶中。结果计算：121页注意：F氮换算为蛋白质的系数 ，一般为 6.25 也可查表。说明： 所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制 。 消化时不要用强火，应保持和缓沸 腾，以免粘贴在凯氏瓶内壁上的含氮化合物 在无硫酸存在的情况下消化不完全而造成氮 损失。 消化时应注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用冷 凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下，并促进其消 化完全。 样品中若含脂肪较多时，消化过程

8、中 易产生大量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在 开始消化时应用小火加热，并时时摇动；或 者加入少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂， 并同时注意控制热源强度。 当样品消化液不易澄清透明时，可将 凯氏烧瓶冷却，加入30过氧化氢 23 m1 后再继续加热消化。 若取样量较大，如干试样超过5 g 可按每克试 样5 m1的比例增加硫酸用量。 般消化至呈透明后，继续消化30分钟即可，但对于含有特别难以氨化的氮化合 物的样品如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、 酪氨酸或脯氨酸等时，需适当延长消化时间 。有机物如分解完全，消化液呈蓝色或浅绿 色，但含铁量多时，呈较深绿色。 蒸馏装置不能漏气。 蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色

9、不生成氢 氧化铜沉淀，此时需再增加氢氧化钠用量。氢氧化铜在7090时发黑。 蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离 液面清洗管口，再蒸1分钟后关掉热源否则 可能造成吸收液倒吸。二、 微量凯氏定氮法1、原理及适用范围同前2、与常量法不同点：加入硼酸量有50 ml 10 ml,滴定用盐酸浓度由0.1 mol/L 0.01 mol/L ,可用微量滴定管。3、蒸馏装置 。10-210-2三、 自动凯氏定氮法1、原理及适用范围同 前2、特点： （1）消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化 瓶，红外线加热的消化炉。 （2）快速：一次可同时消化8个样品，30 分钟可消化完毕。 （3）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收和滴 定

10、，自动数字显示装置。可计算总氮百分含量 并记录，12分钟完成1个样。北京福德泰和科技有限公司产品名称： 凯氏定氮仪 二、双缩脲法传统的凯氏定氮法应用范围广，灵敏 度高、准确，不要大仪器，但费时间，有环境 污染。 新开发的：双缩脲法、紫外分光光度法、染料结合法、水杨酸比色法等。1. 原理 脲（尿素）NH2CONH2 加热至 150160时，两分子缩和成双缩脲。双缩脲能和硫酸铜的碱性溶液生成紫红色色络合物， 这种反应叫双缩脲反应。（缩二脲反应） 蛋白质分子中含有肽键 CONH 与双缩脲结构 相似。在同样条件下也有呈色反应，在一定条件下， 其颜色深浅与蛋白质含量成正比，可用分光光度计来 测其吸光度，

11、确定含量。（560nm）NH2CONHCONH2 + NH3NH2CONH2 + NH2CONH2注：测蛋白质时叫双缩脲法，并不另加双缩脲。 样品不用消化2.方法特点及应用范围本法灵敏度较低，但操作简单快速，故在 生物化学领域中测定蛋白质含量时常用此法。 本法亦适用于豆类、油料、米谷等作物种子及 肉类等样品测定。 3.主要仪器： 分光光度计，离心机（ 4000 r/min）4. 试剂： (1) 碱性硫酸铜溶液(2) 四氯化碳6说明及注意事项： a. 蛋白质的种类不同，对发色程度影响 不大； b.标准曲线制作完整后，无需每次再做 标准曲线； c.含脂肪高的样品应预先用醚抽出弃去 ； d.样品中有

12、不溶性成分存在时，会给比 色测定带来困难，此时可预先将蛋白质抽出 后再进行测定； e.当肽链中含有脯氨酸时，若有多量糖 类共存，则显色不好，会使测定值偏低。三紫外吸收法 （一）A280nm光吸收法 1原理：蛋白质及其讲解产物（月示 胨 肽 氨基酸）的芳环残基 R（ NHCHCO）在紫外区对一定波长的光具有选择吸收作用。280nm 下，吸光度与蛋白质浓度（3-8mg/mL）成直线关系 。用凯氏定氮法确定蛋白质含量的标样做标准曲线。2适用范围：常用于生物化学工作，因为干扰因素多，故在食品分析领域应用不广泛。3主要仪器： 紫外分光光度计 离心机（3000 5000 r/min）4操作：用凯氏法测定作

13、标样做标准曲线5说明及注意事项a.测定牛乳样品时的操作手续：准确吸取混合均匀的样品0.2ml与25ml纳氏比色管中，用95-97%的冰醋酸稀释到标线，摇匀，以95-97%的冰醋酸为参比液，用1cm比色皿于280nm处测定吸光度，并用标准曲线法确定样品蛋白质含量（标准曲线用凯氏定氮法测出蛋白质含量的牛乳标样绘制）。b.测定糕点时，应将表皮的颜色去掉。c.温度对蛋白质水解有影响，操作温度应控制在20-30。三紫外吸收法 （二）肽键紫外测定法 1原理：蛋白质溶液在238nm下均有光吸收， 其吸收强弱与肽键多少成正比，可测定样品在238nm 下的吸收值，与蛋白质标准液做对照，求出蛋白质 含量。 本法比

14、280nm法灵敏。醇、酮、醛、有机酸和过氧化物等都有干扰作用，最好用无 机酸、无机碱和水作为介质溶液。若含有有机溶剂，可将样品先蒸干，或用其他方法除去干扰 物质，然后用水、稀酸或稀碱溶解后再做测定。50-500mg/L蛋白质范围线性良好。四、福林-酚比色法1.原理：蛋白质与Folin-酚试剂反应，产生蓝色复合物。机理：蛋白质中的肽键与碱性铜盐产生双缩脲反应，同时 ，由于蛋白质中存在的酪氨酸与色氨酸同磷钼酸-磷钨酸试剂反应产生颜色，呈色强度与蛋白质含量成正比，是检测可溶性蛋白含量最灵敏的经典方法之一。2.试剂：福林-酚试剂甲、乙、牛血清蛋白标准溶液3.操作方法：P1274.说明：灵敏度高，实测下

15、限较双缩脲法约小2个数量级。对双缩脲法有干扰的物质对本法影响更大。酚类、柠檬酸有干扰。五、考马斯亮蓝染料比色法1.原理：G-250与蛋白质通过范德华力结合，蛋白染色，在620nm处有最大吸收。2.特点：简单快速，适合大量样品测定，灵敏度类福林酚法，不受酚类、游离氨基酸和小分子的影响。3.试剂：牛血清蛋白标准液、G-2500-100mg/L线性关系良好。六、水杨酸比色法1.原理：样品中蛋白经硫酸消化转化成铵盐溶液后，一定酸度和温度条件下与水杨酸钠和次氯酸钠作 用生成蓝色化合物，660nm处比色测定，求出样品含氮量，计算Pro含量。2.说明：样品消化完全后当天进行测定结果的重现性好，样液放至第二天比色即有变化；温度对显色影响极大，故应严格控制反应温度；对谷物及饲料等样品的测定证明，此法结果与凯氏定氮法基本一致。七、红外光谱法1.原理：食品中不同功能基团吸收不同频率的辐射。对于蛋白质和多肽，多肽键在中红 外波段（6.47m）和NIR波段（如3300-3500nm、2080-2220nm，1560-1670nm）的特征吸收可用于测定食品中的蛋白质含量。2.应用：红外牛乳分析仪、近红外光谱仪八、4,4