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1、动物学报 49(5) :670674 , 2003 Acta Zoologica Sinica 2003202227收稿, 2003206220修回3 国家自然科学基金(40172005)资助 This research was funded by a grant from the National Natural Science Foundation of China (No.40172005) 33 通讯作者(Corresponding author) . E2mail : zhonglailiu 第一作者简介 钟华,男, 25岁,硕士。 研究方向:分子遗传学。E2mail : zhong
2、qihua 2003动物学报Acta Zoologica Sinica一种从大熊猫粪便中提取DNA的改进方法3钟 华 赖旭龙 魏荣平 刘中来 33(华中师范大学生命科学学院,武汉430079)(中国地质大学地球科学学院,武汉430074) (中国保护大熊猫研究中心,四川卧龙623006)摘 要 本研究描述一个改进的方法,使从大熊猫粪便中提取DNA用于PCR扩增变得更加容易。在粪便DNA的提取过程中采用一个新的预处理方法,将粪便用预冷的丙酮洗23次,除去粪便中含有的大量PCR抑制物,然后用蛋白酶K裂解、酚-氯仿抽提,能提取到纯度很高的DNA供PCR扩增。本实验PCR扩增了大熊猫脑源性神经营养因子
3、(BDNF)基因和线粒体细胞色素b基因片段,并进行测序分析,证实了提取的可靠性。对比本方法和未经丙酮预处理的方法提取的DNA进行PCR扩增,前者的扩增结果明显优于后者动物学报49 (5) :670674 , 2003。关键词 大熊猫 粪便DNA 丙酮 DNA抽提 非损伤性取样An improved protocol for DNA extraction from the faeces of the giant panda3ZHONG Hua LAI Xu2Long WEI Rong2Ping LIU Zhong2Lai 33(College of Life Science,Central Ch
4、ina Normal University ,Wuhan 430079, China)(Faculty of Earth Sciences ,China University of Geosciences ,Wuhan 430074, China)(China Conservation and Research Center for the Giant Panda ,Wolong 623006, Sichuan , China)Abstract An improved method that facilitates the extraction of PCR2compatible faecal
5、 DNA from giant pandas faeces is described. The method involved a novel preprocessing step in DNA extraction. The faeces was washed two or three times with precooled acetone , which removed numerous potential PCR inhibitors , and then digested with proteinase K. The DNA was purified with phenol/ chl
6、oroform. The faecal DNA obtained was sufficiently pure to support reliable amplifica2 tion , and was applied as template DNA to amplify a portion of the giant panda brain derived neurotrophic factor (BDNF) gene and mitochondrial cytochromebgene. The sequenced resultsof PCRproducts confirmed that the
7、 extracted DNA was from the giant panda. Comparison with the PCR products demonstrated that the faecal DNA extracted by the improved protocol was better than the faecal DNA extracted without acetonepreprocessing.Acta Zoologica Sinica49 (5) : 670 - 674 , 2003. Key words Giant panda( Ailuropoda melano
8、leuca), Faecal DNA , Acetone , DNA extraction , Noninvasive sam pling在大熊猫的遗传多样性、种群数量调查、进化 和分类、亲子鉴定等研究中, DNA分析是重要的 研究手段。但对于濒危动物大熊猫而言,传统的损 伤性取样是危险的。因此,寻找简便安全的DNA提取途径显得极为重要。到目前为止,出现了许多 非损伤性取样法,如收集脱落的毛发、粪便、尿 液、食物残渣、鱼鳞和卵壳等不同形式的样品进行 遗传分析。Hsset al.(1992)发表了第一篇关于从棕熊的粪便中获得DNA的文章,实验用硅粒沉 淀DNA取代了酚-氯仿抽提来纯化DNA ,成
9、功测 定了其mtDNA的部分序列,表明粪便可用来对稀 有物种进行分子遗传研究。但由于粪便中含有大量Taq聚合酶的抑制物质,很多方法提取的DNA其 扩增效果不佳,如Hss在PCR反应中就加了牛血 清蛋白来克服抑制剂对Taq聚合酶的抑制作用。 目前采取的方法有多种,作者将其大致分两类:(1)粪 便 裂 解 后 纯 化DNA ,如Ernestetal.(2000)在粪便经蛋白酶K处理后,用酚-氯仿多次抽提,然后, DNA溶液经聚丙烯酰胺葡聚糖柱 子洗脱来纯化DNA ; Taberletet al.(1996)、Reedet al.(1997)和Parsonset al.(1999)用硫氰酸胍处理粪便
10、,直接用硅粒沉淀DNA而使之与杂质 分离达到纯化的目的; Constableet al.(1995)和Savillet al.(2001)在用蛋白酶K裂解粪便的同 时 另 外 加 入 了 十 六 烷 基 三 甲 基 溴 化 铵(Cetyltrimethyl2ammoniumbromide , CTAB)消 化PCR反应抑制物,再经多次酚-氯仿抽提纯化DNA ; Dinget al.(1998)将DNA抽提试剂盒 (XTRAXTM DNA Extraction Kit , BIODESIGN In2ternational)应用于大熊猫的粪便DNA提取, Ten2gelet al.(2001)介绍
11、了提取粪便DNA的试剂盒(QIAamp DNA Stool Mini Kit , Germany)清除PCR抑制物; Reedet al.(1997)将碱性多价金属 离子 螯 合 树 脂Chelex2100应 用 于 清 除 抑 制 物(Reed在自己的文章中已证明该方法并非理想)。 这些方法或操作繁琐,花费高,或结果不十分理想,或缺乏实验室通用性。(2)粪便预处理,如Deuteret al.(1995)先将粪便于- 80 冷冻,再 匀浆,经两次差速离心除去了残渣,但经过柱洗脱 才得到了纯度高的DNA ; Lantzet al.(1997)利 用聚乙二醇和葡聚糖40组成的二相系统对粪便进行预处
12、理,很理想地除去了PCR抑制物,但花费 较高,缺乏通用性; Machielset al.(2000)用磷 酸缓冲盐溶液和酚-氯仿-异戊醇组成的二相系统 对粪便预处理,但其后的处理过程十分繁琐。 我们介绍一种在细胞裂解前经丙酮预处理的抽提方法。丙酮是一种优良的有机溶剂,在DNA的 提取过程中曾被用来消除抑制物,有很好的效果 (Schneiderbaueret al., 1991 ; Udyet al. ,1994 ; 施苏华等, 1996 ; Purohitet al. , 2003)。本实验 预处理中丙酮能很好地将粪便中的色素、多糖及一些有机盐等PCR抑制物除去,最后得到的DNA可 用于PCR
13、扩增,并用于进一步的遗传分析。1 材料与方法111 材料 大熊猫月月血液样品、粪便样品、毛发样品,由卧龙自然保护区提供。大熊猫健健(来自卧龙) 新鲜粪便样品、毛发样品由武汉动物园提供。112 试剂蛋白 酶K和p GEM2T vector System产 自Promega公司;TaqDNA聚合酶、dNTP和DNAExtraction Kit购自晶美公司(产自MBI , Fermen2tas公司)。113 方法11311 DNA的提取 (1)取215 g粪便于灭菌的烧杯中,加适量TE (10 mmol/ L Tris2HCl , 1 mmol/ L EDTA , pH810)溶解,搅拌充分,静置2
14、 min。(2)取上清110 ml于115 ml Eppendorf管中,做10管左右, 4, 300 r/ min离心5 min ; (3)上清转入另一离心管中, 4, 1 500 r/min离心5 min ,沉淀细胞。(4)加015 ml丙酮( - 20 预冷)混匀洗沉淀1 min , 4, 1 500 r/ min离心5 min ,沉淀细胞。此步重复23次,倾去丙酮。 (5)加600l TE , 40l溶菌酶(50 mg/ ml) ,37 放置30 min。(6) 4, 1 500 r/ min离心5 min ,取沉淀。(7)加500l裂解液(200 mmol/ L NaCl ,100
15、mmol/ LTris2HCl , pH 810 , 210 % SDS , 50mmol/ L EDTA , 110 % Triton X2100) , 1215l蛋 白酶K (20 mg/ ml) , 55 温浴3 h或过夜。(8)加1125l RNase (10 mg/ ml) , 37 保温30 min。(9)加等体积酚 氯仿 异戊醇(25241)混 匀置2 min , 4, 14 000 r/ min离心10 min ,取上 清液(400l)至另一干净Eppendorf管中。(10)加入等体积异丙醇或两倍乙醇混匀,- 20 放置30 min或过夜, 4, 14 000 r/ min离
16、心15 min。 (11) 500l 70 %乙醇洗涤沉淀, 4, 14 000r/ min离心2 min ,倾去上清液,沉淀自然干燥后 加20l TE溶解。 血液DNA的提取参照Wanget al.(1994)的方案,毛 发DNA的 提 取 参 照Higuchietal. (1988)的方案。为防止交叉污染, 3种样品DNA的提取于不同时间地点进行。11312 PCR扩增 根据在NCBI上已发表的大熊猫脑源性神经营 养因子(BDNF)基因的序列(U56638) ,采用软件GENERUNR设计引物:上游引物(起始位38)5TCGGTTGCATGAAGGC 3;下游引物(末位668) 5TTGCTATCCATGGTAAGGG 3 。扩增在1765期钟 华等:一种从大熊猫粪便中提取DNA的改进方法PTC2100型PCR仪上进行,采用25l反应体积:10缓冲液215l
