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1、湖北中医学院硕士学位论文复方苦荞麦对实验性糖尿病大鼠早期肾脏病变影响的实验研究姓名：胡慧申请学位级别：硕士专业：中医基础理论指导教师：张正浩2003.6.1湖北中医掌院烦 研究生毕啦沦史中文摘要萄昀0 本落邂观察了夔方苦养麦对腹艘注射链艨敢莹素( S T Z ) 3 天后诱导影成酶 糖艨病酬) 夫鼠体燕、蟹重、肾蓬稽数( 瞥覆体重j 、焱禳、癜舰酹、血尿 素氮、慧艟灌薅、爨密度瓣蛋鑫、低密度鼹委巍、营蘧三艨、1 2 h 藤总蚕渔耩 灌螯及黉鳃织转诧生羲霆子雾l ，I V 型茨嚣魏雾嚼，以溪璃谈稍裁霹早黧塘暴病 肾瘸( D N ) 太鼠的防治作用及其可能的作用机制。， 方法f健潦雄幢W is t
2、 a r 大鬣6 1 只，遗应牲蠛葵l 周活开始实验。随舰分为2 组， 一簸1 i 只侈秀正鬻对照鳃；莠一愆5 0 只攘5 0 m g k g 裁量一次性黢整注辩0 。5 链脲佐菌索( S T Z ) 诱发D M ，3 天后测空腹血糖，井观察饮水、进食及尿爱燮化。 以血糖 1 6 。7 m m 0 1 L 喾定荛脒鳃。粼大鼠隧撬分糟4 鳆，连蘸歪紫对爨缝共量 5 缀，鬻委常对照鳃( 篱稼正常缀) 。复方营养麦簿裁量鳃( 麓称高蓑羹鳃；、 复方苦嚣爱低剂量组( 简称低剂量缎) 、消渴丸组、模型对照组( 简称模型纽) 。 残模次蓦帮嚣始治疗，鬻缀分裂给激复方管葬爱簿、餐裁薰蓊痕、清渗丸潺慧 液、生
3、理簸水灌胃，繇器一次，嘲辩正絮对照鳃给予等受嫩瑷蕴瘩。治疗期间 均不限懿遴食、嫒水，躐察避食、饮表量、屎薰莓一般滂撼。治黎8 凰蘑处冤 各组大鬣，渡集血、藤标本，检测体重、瞥重、肾壤指数( 瞥藿体重) 、擞糖、 血肌酐、赢尿素氮、总胆固醇、甘油三脂、高崔度脂蛋白、低密度脂蛋白、1 2 h 暴总蛋逸接漤量及遘逶免疫荧光筑察翳鳃织转德生长蠢予赛l 。t V 麓羧嚣+ 烧有 实验数豢麓攥S P S S 款停惫避雩亍统讨擎处理。结聚l体重治疗前，卷鳃大鼠体重光照著性黢异；治疗后，横溅鳃体燕继续下降， 露正常鳃倭燕继续上舞，薄磺跑较鸯嚣常受善魏蓑羚，P 0 0 5 ；毽姥较歪 掌对蒺燕是饕舞囊，P o
4、。0 1 ；治疗嚣，各滚疗筑鑫糖麓莪潦疗蔷及较模羹缀显 著下降，P o o l ，麓中高剂量组降嫩糖效果较好。3血脂甘油三脂：备治疗组均显著低于横裂皴，P O 0 5 A f t e rt r e a t m e n t , t h eb o d yw e i g h to fm o d e lg r o u pk e p to nd e c r e a S i n g ，w h i l et h a to fn o r m a lg r o u pk e p to ni n c r e a s i n g ，w h i c hi n d i c a t e dt h e r ew a sv
5、e r ys i g n i f i c a n td i f f e r e n c eb e t w e e nt h e m ，P 0 ，0 5 ，b u tt h el e v e l so t b l o o dg l u c o s ei na l lt h e s eg r o u p sw e r eh i g h e rt h a nt h a to ft h en o r m a lg r o u p ，P 1 6 7 m m 0 1 L 者作为糖尿病模潮靶中医学院簸| 删 究生毕瞧论文烈鼠，共成模43 只。喂养8 周后，即成为早期糖尿瘸肾病大鼠模型“1 。 2 2 动物分
6、组 毒争4 3 只戒模鼠夔规分为炱方苦葬麦燕翔量组( 1 1 只) 、复方磐募麦甄劐餐 鳃( 1 1 只) 、消灞丸组( 10 只) 、模型对照雏( 1 1 只) 4 缝，加上正常对照鲤( 1 1 只) 共5 组5 4 只大鼠。 2 ，3 治疗方法 糖暴病大躐造横成功蘑各组邵开始投l m l l O O g 剡爨灌霉治疗 正常筑：灌骧生理羲永；l m l 1 0 0 9 体重 模型组：灌服生理盐水；l m l 1 0 0 9 体重 低剂量组：灌服复方营养麦低剂量菊液；l m l 1 0 0 9 体重 离剂量组：灌嘏复方营葵麦毫剂墼药滚；l m t 1 0 0 9 体重 消遥充鳃：灌驻溃遥克混愚
7、滚；l m l 1 0 0 9 露重 上述五组犬鼠每日灌褥治疗一次，均不限制进食及饮水，治疗周期为8 周。 2 4 标本采集 治疗8 周采集标本翦，大鼠停药、絷食、不禁水12 小时，称体重，尾静脉 呆盎澜矗蘧。建代诲笼浚榘凌浚1 2 ，l 、瞬藤耋容器串如苯甲酸跨瘸) ，裣潮爨 总蛋白排泄薰。 大鼠麻醉厝以摘除眼球法采血3 m l 5 m l ，取血清，用于检测颤尿素氮、血 肌酐、总胆凰辫、高密度脂蛋自、低密度脂蛋白、甘油三脂，血样室温静置半 天蓐离心莠送徐。在氯叛上疆定夫羲，缀旋主毒辣撬管，臻生理簸东充分灌浚 肾脏至发白，统一取左肾，剔除包膜，用滤纸吸干水分，用电予天平称肾脏湿 魄后，置于4
8、 多聚甲醛液中固定4 8 小时，送武汉大学医学院病理科，取材、 脱水、透明、石蟮包埋、切片( 厚度5 “m ) ，检测T G F 。、I V - C 的裳达。 2 。5 瑷察耱撂毒接蠡硷测方法 2 5 1 一般状况 每日观察大鼠进食、饮水情况，尿爨，以及皮氇光泽度，精神状况，活动 度等变化。 2 ，5 。2 盘耱用美国强壤公司O n e t o u c h P r o f i l e 稳捷全缒墼赢耱便及配套试纸瓣定，滴 一滴血至待测试纸中央，4 5 秒钟后读取谈数。 2 5 3 免疫荧光病理学观察 理察肾小壤基藏簇、瞥小球系骥嚣T G F ，、I V - C 妁表达，蒡且使援 H P I A
9、S 一1 0 0 0 薄溥晰度彩色瘸瑾匿文报告分街系统避荦亍计算视图象分耩。 2 5 4 生化指标检测血样送趸浅汉大学中南医院检验科，弼簿：均糖测定法测H 跣一e H 、L D L - C I q ；索氮、酶法检测血蕊酝。酶比色法测T G ；酶联比色法测血总胆繇酶一谷氨酸黢氢酶磅态毙色法嚣盘撼通过T O S H I B AT B A 一1 2 0 F R 全自动生化分析仪等仪瓣检测。 2 ，5 5 免疫荧光指标检测S A B C F I T C 免疫荧光法检测努驻组织中T G F ，与I V - C 表达。T G F ；孝廿I V - C 免疫荧光染色在武汉大学嚣学院病理垒鬟教研室老释稽导下独
10、立宠戚，蚕豫分N - I L 中医学院坝H 川究生毕业论史析以及半定量分析由武汉大学医学院借用H P I A S 一10 0 0 高清晰度彩色病理图文 报告分析系统协助完成。 S A N 一F I T c 免疫荧光法具体操作步骤如下： ( 1 ) 切片在二甲苯中脱蜡，经各级乙醇脱水。 ( 2 ) 双蒸馏水新鲜配置3 H ，0 ，室温10 分钟以灭活内源性酶。双蒸馏水洗 2 分钟3 次。 ( 3 ) 将做T G F 一0 、的切片浸入0 0 1 t 4 柠檬酸盐缓冲液( P H 6 0 ) ，电炉加热至 沸腾后断电，间隔l0 分钟后，再加热至沸腾后断电，室温下冷却，用0 1 MP B S 洗2
11、分钟3 次；将在做I V - C 的切片标本上，滴加一滴复合消化酶，室温下置10 分钟后，用双蒸馏水洗2 分钟3 次。( 4 ) 滴加用0 1 MP B S 稀释( 1 ：2 0 ) 正常山羊血清封闭液，室温20 分钟后， 甩去多余液体，不洗。 ( 5 ) 滴加用0 1 MP B S 稀释的兔抗大鼠T G F p ( 1 ：10 0 ) I g G 、小鼠抗大鼠 c I V ( 1 ：5 0 ) I g G ( 一抗) ，3 7 恒温箱中孵育1 小时后。用0 1 MP B S 洗2 分 钟x3 次。 ( 6 ) 滴加生物素化山羊抗兔I g G ( 1 ：1 0 0 ，二抗) 或山羊抗小鼠I g
12、 G ( 1 ：10 0 ) ，c ，3 7 恒温箱中孵育2 0 分钟后，0 1 MP B S 洗5 分钟4 次。( 7 ) 滴加试剂S A B C F I T C ( P B S 稀释或1 ：10 0 ) ，3 7 恒温箱20 分钟，0 1 M P B S 洗5 分钟4 次。( 8 ) 将已预热至6 0 * ( 2 的甘油明胶封片，即刻用荧光显微镜观察并拍片。 结果采用H P I A S 一10 0 0 高清晰度彩色病理图文报告分析系统进行半定量分 析，每张标本按顺序选10 个视野，计算每个视野内染色区域的平均吸光度，以 均值计算每个标本的吸光度，最后以每组的均值进行比较。2 5 612 h
13、 尿总蛋白排泄量的测定用代谢笼收集大鼠尿液，送至武汉大学中南医院检验科，苦味酸法检测尿 总蛋白含量。 3 统计学处理 各计量资料均采用S P S S1 1 0F o rW i n d o w s 软件对数据进行统计处理，实验结果以均数标准差( _ ；s ) 表示，单因素多个样本均数的比较用方差分析， 多样本均数两两比较采用q 检验，各组前后比较用配对资料的t 检验。6湖北中医学院颅L W 究生毕弛论文结果1复方管荞麦对糖尿病大鼠一般状况的影响： 模型组大鼠在腹胶注射S T Z3 天后出现多饮、多尿症状，进食量较正常鼠 暖显增加虽壤榜萎黪，活动减少。治疗期闯，模登鳃夫鼠孛孥续多饮、多屎、多 食，
14、消瘦蛹显，藕神绥怠，活豪减少，毛发梧编。 复方菅荞麦低剂戡组和消渴丸纽与模型组相比，饮水量、尿量、饮食餐均 明显减少，体重下降减缓，精神状态、活动度和毛色有所好转；但与正常组比 较，仍露多饮、多尿、多食、消瘦瘥轶。 爱方瞢荞麦高裁薰蠢与模型缀稳跑，多钦、多象、多食臻显好转；体重与 治疗前相比无明显降低，在抑制消瘦方面比其他治疗组更好；大鼠的精神状态、 毛色、活动度方面强于低剂量组和消渴丸组。 实验过程中，模裂鳃死亡4 只，其中一只糖露亡前表爨狂燥，攻击性强， 萝态不稳，箍嚣可能囊子盘耱遗篱敬中褪耱经系统窃藏簿礴掰致；莠两只死亡 后解剖发现肠梗阻、肠胀气，甚至肠坏死，可能为高血糖引起的自主神经病
15、变， 引起肠蠕动缓慢，直鬣肠梗阻、坏罗E ；还有一只是合并肺部感染死亡。小剂量 组死亡2 只，一只系棚互撕咬致死，是一只为髓梗阻、坏死辫致。大刹爨鳃死 亡1 只，海治疗毂始瀵嚣襟嚣不骞。溃浯丸燕冤亡1 只，系合并薜都惑絷掰致。各组大鼠治疗前詹体重情况具体见表1 。 表1治疗蕊后各组大鼠体重的比较( ；s )与正常组比较P 0 0 5 ；模型 组治疗翦后无铙显改交，P 0 0 5 ；治疗后，各治疗组血糖显著下降，与模型组 比较均有非常显著性差异，P 0 0 1 ；高剂璧组与消渴丸组相比有疑著差异，P 0 0 1 ；各治疗组血糖均较治疗前显著下降，P 0 0 5 。 提示：治疗前糖尿病模型是成功的
16、，n 高血糖无自然缓解现象。复方 苦棼麦麓、低裁量组均可降低糖屎病大鼠血糖，且以高刹量组为优。 3 复方营萋麦对攘暴瘸大惑矗嶷羲影嚷，楚袋3 ： 表3 治疗君各组大羲巍穗的跑较( i t 。)与模型组比较P 0 0 I与消渴丸组比较P 0 0 5 由液3 可见，8 周后，与模型组比较，复方苦荞麦高、低剂量组和消渴丸 组大鼠T G 、L D L - C H 、T C H 均最著降低，P 0 。0 1 ，其中以高剂量组降低T G 、L D L - C H 、 T C 疗效荛侥。与模型鳃跑较，复方苦葵麦鬻、低裁量鲤移淡潺丸鳃太羲均可 蔓箬舞巍盘潘H D L e H ，P 0 。0 1 ，瑷褰裁萋筑舞离盘渍H D L - C H 疗效为饶。 提示：复方菩葵爱可降低糖屎病大鬣血精，改善糖尿病精代谢紊乱，且 降脂疗效与剂量呈正相必。 4 复方苦荞麦对糖尿病火鼠尿素
