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1、两种提取红细胞膜蛋白方法的比较在制备抗血型抗原单克隆抗体时，为了提高红细胞血型抗原的免疫效果，获得更多的阳性克隆，我们比较了两种提取红细胞膜蛋白的方法。1 材料和方法1.1 低渗溶血法粗提红细胞膜蛋白1.1.1 方法一 略有改良 取 25 ml A(或 B ) 型抗凝混合血加 0.01 mol/L PBS ( pH7.4)，离心 3000 r/min，20 min，弃上清和上清下的白细胞、血小板层。用相当于红细胞压积 3 倍的预冷 PBS(pH7.4)洗涤 3 次(4 5 000 r/min,15 min)。加预冷的 0.01 mol/L Tric-HCl(pH7.4)与红细胞(VV=401)
2、混合，4放置 2 h。再以 9 000 r/min 离心 20 min，弃上清(重复 35 次)至无肉眼可见的红细胞为止。沉淀物加 0.01 mol/L PBS(pH7.4)置-20保存。1.1.2 方法二 略有改进 4 ml A(或 B)型血加 40 ml NS,离心 2 000 r/min,20 min,洗 3 次。沉淀物加入 40 ml 预冷蒸馏水，离心 5 000 r/min,10 min，洗 4 次。因沉淀物中仍有少量红细胞，故加 40 ml 0.01 N 冰醋酸，置 4 2 h后离心 9 000 r/min，15 min。沉淀物加 4 ml NS 混匀后，再加 0.2 ml 0.1
3、 N NaOH，室温 30 min,离心转速同上，弃上清后加 4 ml NS,用 0.1 N HCl(约 0.1 ml)调 pH 至 7.4。紫外分光光度计测蛋白含量。1.2 红细胞膜抗原的活性测定1.2.1 血凝抑制试验 将提取的 A(或 B)型红细胞膜蛋白倍比稀释，分别加相应抗体(原液1128 倍比稀释)，震摇后置室温 1 h，再加入 2%A 或 B 型红细胞，水平振荡 20 min,室温静置 1 h 观察结果。另用 A 或 B 型红细胞代替 A 或 B型红细胞膜蛋白作为对照。能使加入的 2%红细胞不出现凝集所需膜抗原的量作为膜抗原的血凝抑制效价。1.2.2 60Co 照射对膜蛋白抗原活性
4、的影响 将提取的红细胞膜蛋白用 15 000 rad 照射后，倍比稀释成不同浓度，用18 的 A 或 B 型血型抗体做血凝抑制试验 3。1.2.3 膜蛋白抗原免疫效果观察 将分别以 10%红细胞和A、B 型膜蛋白抗原免疫 BALB/c 小鼠(4 次)所获血清，分别与 2%A(或 B)红细胞作血凝试验测定血型抗体效价。2 结果和讨论2.1 红细胞膜蛋白量的测定 用两种方法提取的红细胞膜蛋白中镜下观察均无完整红细胞。所获蛋白量以 100 ml 容积的细胞计算，方法一和方法二提取的 A 型膜蛋白量分别为120160 mg 和 50 mg,B 型膜蛋白量分别为 260 mg 和 68 mg。2.2 膜
5、蛋白抗原的活性测定 以能完全抑制相应抗体(原液)与红细胞产生凝集反应所需膜蛋白量来判定。方法一提取的膜蛋白 A 型为 7.515 mg/ml，B 型为 13.6 mg/ml；方法二提取的膜蛋白 A 型为 7.515 mg/ml,B 型为 11.6 mg/ml。2.3 60Co 照射后对膜蛋白抗原活性的影响 将所提膜蛋白抗原于照射前后做血凝抑制试验，结果是：方法一提取的膜蛋白抗原，A 型照射前后分别为 0.26 mg/ml 和 0.130.26 mg/ml;B 型分别为 0.11 mg/ml 和 0.26 mg/ml；方法二提取的膜蛋白抗原，A 型照射前后分别为 0.24 mg/ml 和 0.4
6、7 mg/ml；B 型分别为 0.1 mg/ml 和 0.34 mg/ml。2.4 完整红细胞与膜蛋白抗原的免疫效果 以 10%红细胞免疫 BALB/c 小鼠产生的抗体效价 A 型为 1801512,B 型1801512。A 型膜蛋白抗原免疫 BALB/c 小鼠产生的抗体效价为 151211024,B 型为 125611024。用 A 型红细胞和 A 型膜蛋白抗原免疫 BALB/c 小鼠的脾细胞与Sp2/0 骨髓瘤细胞进行融合，所获杂交瘤细胞的阳性率分别是 0.7%和 11.5%。本文采用两种低渗溶血法提取的红细胞膜蛋白抗原量有所不同，方法一高于方法二。但两种方法所获膜蛋白抗原都具有血凝抑制活
7、性。因免疫动物所需抗原必须无菌，故对提取的膜蛋白抗原进行了 60Co 照射。照射后对 A 型膜蛋白抗原活性的影响不大，但可使 B 型膜蛋白抗原的活性下降23 倍。更为重要的是，以照射后的膜蛋白抗原作为免疫原可使融合阳性率较完整红细胞作免疫原提高 15 倍。因此认为本文提取的红细胞膜蛋白抗原不仅简便易行，而且有实际应用价值，尤其是方法一。分离膜蛋白的方法有两种：1 先分离膜，然后提取；2 用特殊的去污剂选择性的分离。第二种方法简单，可靠，但有时含有其他蛋白。原理：4 度时所有的蛋白质原则上都溶于 TritonX114 水溶液，但在 37 度时，此溶液分为水相和去污相；此时亲水性蛋白溶于水相，疏水
8、的膜蛋白溶于去污剂相中。方案1）放射性标记受试细胞2）将标记的细胞放在冰上3）去除上清，用 pH7。4 的冷磷酸盐缓冲液洗涤单层细胞两次4）加入 1ml2%TritonX 溶液冰浴 15min5)刮下单层细胞，4 度下 10 000g 5min 离心6）溶液 37 度水浴 10min 以分离水相和去污剂相，然后 37度下 2 000g 离心 5min7)收集水相留作分析8）用 500ul 冰冷的 buffer C 溶解去污剂相沉淀，冰浴2min 后加温，在按步骤 6 再次离心9）按步骤 8 再次抽提去污剂相，用 buffer C 将洗涤后的去污剂相稀释到初始体积10）用等量的 buffer A
9、 分别稀释水相与去污相，并进行免疫沉淀实验试剂：1）2%tritonX114:2%TritonX114、50mmol/L Tris HCl（pH7。5）、蛋白酶抑制剂2）缓冲液 A（含 0。5mol/LNaCl 的 RIPA buffer）3）buffer C10mmol/L Tris HCl(pH7.5)150mmol/L NaCl5mmol/L EDTA(PH7.5)红细胞膜的制备及其成份分析(磷脂、胆固醇)一、红细胞膜的制备(一 )原理随着生物膜研究的迅速发展，在膜的结构及功能的研究中分离和鉴定生物膜常常是必要的。为进行膜结构的生物化学分析，必须首先分离出纯净的细胞膜。哺乳动物的红细胞膜
10、在分离状态下。一般称为”血影”，其没有通常真核生物细胞内所含有的任何细胞器，经过制备，容易得到纯粹的细胞膜，并且在取材方面来源方便，因此哺乳动物的红细胞膜是研究细胞膜的好材料。从哺乳动物红细胞中分离细胞质膜，第一步，将血液取放在加有抗凝剂的容器内，用低速离心的方法从血液中分离出红细胞，然后用等渗缓冲液重复洗涤多次，去除血浆。第二步，将洗净的红细胞从等渗缓冲液转移到低渗缓冲液中，由于渗透压力作用于细胞质膜，使红细胞膨胀而溶血。最后一步，将溶血的红细胞经过充分反复洗涤高速离心，去除血红蛋白和其他细胞内含物。这样制备所获得的最终产品几乎全是红细胞膜。(二 )仪器、试验材料和试剂仪器冷冻离心机、冰箱、
11、自动移液管、相差显微镜、冷冻干燥机等。原料哺乳动物的血液试剂1. pH7.4 等渗磷酸盐缓冲液 (含有 0.15mol/L 氯化钠的5mL，pH7.4 磷酸盐缓冲液)：贮液 A：称取 0.7808 磷酸二氢钠溶于水，定容至1000mL；贮液 B：称取 3.5828 磷酸氢二钠溶于水，定容至2000mL；取 380mL 贮液 A 加 1620mL 贮液 B，用少量浓盐酸调PH 至 7.4再称取 17.5g 氯化钠加入其中。2. pH7.4 低渗 tris 缓冲液(10mmol/LpH 7.4Tris-盐酸缓冲液)：贮液 A：称取 2.42gTis，溶于水，稀释至 500mL；贮液 B：取 0.8
12、4mL36一 38盐酸，稀释至 100mL；取 500mL 贮液 A 加 414mL 贮液 B，用水稀释至近于2000mL，用 6mol/L 盐酸调 pH7.4，再定容到2000mL。3. 肝素 PH7.4 等渗磷酸盐缓冲液：将肝素溶于 PH7.4 低渗 Tris 缓冲液中，使每毫升含肝素500 单位。(三 )操作步骤1.血液的收集及洗涤将血液收集在含有抗凝剂的容器中，每 30mL 血液加约5mL 肝素pH7.4 等渗磷酸盐缓冲溶液。为避免膜上含有的或膜上吸附的蛋白酶使膜蛋白发生变化，以下操作应在4低温下进行。取 30mL 血液，于冷冻离心机(4)中 3000r/min 离心 20min，使红
13、细胞沉淀，用吸管吸尽血浆及沉淀的红细胞表层的绒毛状沉淀层，以避免其他类型细胞的混入。将红细胞置于 3 倍量预冷的 pH7.4 等渗磷酸盐缓冲液中，用玻璃棒缓慢地搅拌悬浮，45000r/min 离心 15min，除去上清液及沉淀表层，重复洗涤 3 次。2.溶血和红细胞膜的洗涤在洗净的红细胞中，按照 1:40 的比例加入预冷的10mmol/LpH7.4 低渗 Tris(三羟甲基氨基甲烷)HCl 缓冲液，边加边缓慢搅拌，置于 4冰箱中 12h，使之完成溶血。然后于 49000r/min 离心 15min，使红细胞膜沉淀。重复洗涤、离心 35 次，最后获得白色的红细胞膜样品。注意：溶血时低渗缓冲液的用
14、量越大，红细胞膜中血红蛋白的残留量越少，但体积大，离心费时间。因此，红细胞与缓冲液的容量比例，以 1:40 为宜。膜的重量很轻，在溶血后离心倾倒上清液时容易流走，因此要特别小心，尽可能防止膜的损失。在制备过程中，若 pH 值降低，残留的血红蛋白会迅速增加。当 pH 保持在 7.4 时，红细胞膜中的血红蛋白含量仅占总蛋白量的 35，相当于血液中总血红蛋白的 0.1。但 pH 值降低至 7.0 时，血红蛋白增加至 20。上述方法适用于大白鼠和人红细胞膜的分离。牛、猪等红细胞膜的制备，若反复进行低渗处理，将造成膜外表面包含具有乙酰胆碱酯酶活性的酯蛋白脱落，使膜容易破碎，得不到较完整的膜样品。若在低渗
15、缓冲液中加入 1mmoL 氯化钙，即可完全防止这种膜的不稳定性。将最后一次离心所得到的红细胞膜悬浮在 24mLpH7.4等渗磷酸盐缓冲液中。记录悬浮液的总体积。注意，有时在膜的下面有少许未解体的红细胞残留物，不要将这部分残留物悬浮在缓冲液中。3.细胞膜的镜检取少量膜样品悬液，在相差显微镜下进行观察，确定膜制品是否纯净。在视野中纯净的膜为扁圆形，白色，膜表面赂有皱纹。在视野中应不含有完整的红细胞或污染的细菌。4.膜的冷冻干燥样品放在一个称好重量的(在分析天平上准确称量) 小称量瓶中，冷冻干燥至样品全干(冰冻干燥可以过夜，冷冻干燥的样品更易溶于 SDS 溶液中) ，称量带有冷冻干燥制品的小称量瓶，
16、记录膜的产量。将冷冻干燥的膜制品，置于干燥器中保存，以备膜结构成分的分析。二、膜磷脂的分析(薄层层析法)(一 )原理膜中脂类的主要组分是磷脂和胆固醇。本实验用甲醇氯仿可将膜中的脂类组分提取出来，同时破坏疏水作用、使膜蛋白变性，再采用薄层层析法进行磷脂的定性分析及定量测定。(二 )仪器和试剂仪器具塞试管、普通离心机、15cm15cm 玻璃板、薄层层析展层缸、定磷用的全套器材。试剂1. 硅胶 H碱式碳酸镁混合物：称取 97g 硅胶 H，3g 碱式碳酸镁，置研钵中研磨，并混合均匀。硅胶 H碱性硅酸镁混合物：称取 98g 硅胶 H，2g 碱性硅酸镁，置研钵中研磨，并混合均匀。2. 磷脂标准样品混合液：称取磷脂酰乙醇胺，磷脂酰丝氨酸，神经鞘磷脂和卵磷脂等各 5mg，溶于 l0mL 氯仿：甲醇(1:1，V/V)中。3. 氯仿4. 甲醇5. 乙酸6. 氨水7. 碘8. 高氯酸
