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1、学校代码：1 0 5 7 1学号：2 0 0 9 0 1 0 0 0 8J u glo n e 对人低分化鼻咽癌细胞系C N E - 2 Z 细胞生长增殖及裸鼠体内成瘤的影响及机制研究I n v e s t i g a t i o nt h ee f f e c t so fP i n li n h i b i t o ro nh u m a nl o w - d i f f e r e n t i a t e dn a s o p h a r y n g e a lc a r c i n o m a ( N P C ) c e l ll i n eC N E - 2 Zp r o l i f
2、 e r a t i o na n dt h ea b i l i t yo ft u m o rg r o w t hi nn u d em i c e学科门类医学学科、专业病理与病理生理学研究方向年肿瘤学级二零零九级研究生姓名导师姓名起止日期崔平何志巍2 0 0 9 9 2 0 1 2 5广东医学院病理生理教研室二零一二年五月f 嘲必 学位论文独创性声明本人呈交的学位论文系在导师指导下所取得的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得广东医学院或其他教育机构的学位或证书所使用过的材料。作者签名：虹学位论文知识产权声明本人在就读研
3、究生期间所完成的学位论文及其相关成果，知识产权归属学校。本人在毕业离校前会将有关的研究资料和结果全部上交导师，离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，署名单位仍然为广东医学院。学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，可以公布( 包括刊登) 论文的全部或部分内容。导师享有发表学位论文、申请成果和专利的权利。注：保密的学位论文在解密后适用本声明。作者签名：导师签名：日期：日期：j pl jG 6加f 2 、占Z目录中文摘要1英文摘要3l 前言51 1 研究背景51 2 研究目标81 3 研究内容82 材料
4、与方法91 材料92 方法一1 33 结果2 24 讨论3 65 小结4 l参考文献4 2综述4 7综述参考文献5 4论著5 5论著参考文献5 9致谢6 0附录一缩写词中英文对照61附录二在读硕士期间的科研情况6 2C A T A L 0G U EA b s t r a c ti nC h i n e s e ，1A b s t r a c ti nE n g l i s h 3lI n t r o d u c t i o n 51 1B a c k g r o u n d 51 2O b j e c t i v e 81 3C o n t e n t s 82M a t e r i a l
5、sa n dM e t h o d s 92 1M a t e r i a l s 92 2M e t h o d s 1 33R e s u l t s ：! ：14D i s c u s s i o n 3 65C o n c l u s i o n s z 1 1R e f e r n c e s 4 2R e v i e w 4 7R e f e r e n c e sf o rR e v i e w ! ；z ID i s s e r t a t i o n 5 5R e f e r e n e e sf o rD i s s e r t a t i o n ! ；9A c k n
6、o w l e d g e m e n t s 6 ( )A p p e n d i xhA b b r e v i a t i o n 。，。6 1A p p e n d i xI hS c i e n t i f i cr e s e a r c hd u r i n gp o s t g r a d u a t es t u d y 6 2J u glo n e 对人低分化鼻咽癌细胞系C N E - 2 Z 细胞生长增殖及裸鼠体内成瘤的影响及机制研究中文摘要【目的】通过体内外实验方法，研究J u g l o n e 对人低分化鼻咽癌细胞系C N E 一2 Z 细胞体外生长增殖及在裸鼠体内
7、成瘤的影响及机制，探讨P i n l 抑制剂可能用于抗鼻咽癌肿瘤治疗的可能性及奠定以P i n l 为靶点而研发新的抗鼻咽癌药物的实验基础。【方法】1 M T T 法检测J u g l o n e 对人低分化鼻咽癌细胞系C N E 一2 Z 细胞生长抑制作用。2 流式细胞检测J u g l o n e 对入低分化鼻咽癌细胞系C N E 一2 Z 细胞细胞周期和凋亡情况的影响。3 W e s t e r nb l o t 检测J u g l o n e 作用于C N E 一2 Z 细胞后，细胞周期调控蛋白( C y c l i nD 1 ) ，转录因子( N F K Bp 6 5 ) 蛋白水平的
8、表达情况。4 明胶活性分析法检测：P i n l + + 和P i n l - 细胞金属硫蛋白酶9 ( M M P 9 ) 与基质金属硫蛋白酶一2 ( M M P 2 ) 蛋白活性表达情况。5 建立C N E 2 Z 细胞裸鼠移植瘤模型：讨论J u g l o n e 对人鼻咽癌裸鼠移植瘤的生长抑制作用及观察体内肿瘤细胞转移情况。解剖裸鼠，检查颈部、两侧腋部深浅淋巴结、肺及肝等部位得肿瘤转移情况，计算转移率。取移植瘤组织及可疑转移组织，制备切片后，光镜观察肿瘤组织及可疑转移组织的病理变化。免疫组织化学方法检测M M P 9 ，C y c l i nD 1 ，以及N F K B 在裸鼠移植瘤中的
9、表达情况。【结果】1 J u g l o n e 对人低分化鼻咽癌细胞系C N E 一2 Z 细胞生长抑制作用：M T T 法检测不同浓度J u g l o n e ，在2 4 h 、4 8 h 和7 2 h 时细胞生长增殖情况。结果显示，随着J u g l o n e作用时间的延长，对C N E 一2 Z 细胞生长抑制作用逐渐增强，呈现明显的时效关系；随J u g l o n e 浓度的逐渐增加，其抑制作用也逐渐增强，呈明显的量效关系，较对照组相比有统计学意义( P 9 5 ) 用P B S 重悬成1X1 0 7 m l 的细胞悬液，每只裸鼠右侧腋窝皮下接种O 2 m l ，接种第二天，成瘤
10、前给药组开始给药注射J u g l o n e ，待肿瘤平均体积达到1 0 0m m 3 时( S T D 配) 2 0 u 1 继续孵育4h ，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加1 5 0 u lD M S O ，振荡1 0 分钟，使结晶物充分融解。( 4 ) 比色：选择4 9 0 n m 波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。注意事项：选择适当得细胞接种浓度。避免血清干扰：一般选小于1 0 的胎牛血清的培养液进行试验。设空白对照：与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照，其他试验步
11、骤保持一致，最后比色以空白调零。M T T 粉末和溶液保存时都需要避光，用铝箔纸包好就可以。实验的时候尽量关闭超净台上的目光灯来避光。用S P S S1 3 0 统计软件统计分析结果。按以下公式计算细胞生长抑制率生长抑制率= ( 1 实验组O D 值对照组O D 值) 1 0 0 2 2 4 用流式细胞术检测J u g l o n e 作用于C N E 。2 Z 人鼻咽癌细胞后对细胞周期和凋亡情况的影响( 1 ) 细胞培养：铺细胞至6 孔板或者3 5 m m 培养皿，约4 5 1 0 5c e l l s w e l l ，如果要加药物) 在3 7 。C 、1 0 0 相对湿度，含5 C 0 2 、9 5 空气的培养箱预培养1 2h ，待细胞贴壁后，用血清饥饿法使细胞同步化。细胞贴壁后，加入不同浓度的J u g l o n e于
