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1、天津医科大学博士学位论文PTEN基因过表达对移行上皮癌细胞系生物学行为的影响及膀胱 癌组织PTEN基因突变的研究姓名：乔宝民申请学位级别：博士专业：泌尿外科指导教师：孙光2003.5.1走津区科大学博士学位论文英文缩略语A K T ( P K B ) P r o t e i nk i n a s eB ，A k tC D C SC D KE C ME R KF A KL o HM A P KM I - M S IM M Cp 1 3 0 。1 5P 7 0 s 6 。P C R S S C PP D KP 1 3 KP I P 3P T E NT H PC o w d e ns y n d r
2、 o m e 多发性错构瘤综合症C y c l i nd e p e n d e n tk i n a s e周期素依赖性激酶E x t r a c e l l u l a rm a t r i x细胞外基质E x t r a c e l l u l a rs i g n a l r e l a t e dk i n a s e 细胞外信号调节激酶F o c a la d h e s i o nk i n a s e聚焦粘附激酶L o s so f h e t e r o z y g o s i t y杂合性丢失M i t o g e n a c t i v a t e dp r o t e
3、i nk i n a s e丝裂原活化蛋白激酶M i c r o s a t e l l i t ei n s t a b i l i t y微卫星不稳定性M i t o m y c i n丝裂霉素p 1 3 0C r k a s s o c i a t e ds u b s t r a t eR i b o s o m a lp r o t e i nS 6k i n a s eP C R - S i n g l e - s t r a n dc o n f o r m a t i o n a lp o l y m o r p h i s ma n a l y s i s聚合酶链反应单链构象
4、多态分析3 - p h o s p h o i n o s i t i d e - d e p e n d e n tp r o t e i nk i n a s e3 磷脂酰肌醇依赖性激酶P h o s p h o i n o s i t i d e3 - k i n a s e磷脂酰肌酵3 激酶P h o s p h a t i d y l i n o s i t o l3 , 4 ，5 一t r i s p h o s p h a t e3 , 4 ，5 一三磷酸磷脂酰肌醇P h o s p h a t a s ea n dt e n s i nh o m o l o gd e l e
5、t e do nc h r o m o s o m et e nP i r a r u b i c i n毗柔比星天津匪科夫学博士学位论文P T E N 基因过表达对移行上皮癌细胞系生物学行为的影响及膀胱癌组织P T E N 基因突变的研究研究生：乔宝民导师：孙光摘要膀胱癌为泌尿系统最常见的肿瘤，在西方是第5 位常见的肿瘤，占所有癌症患者的4 在癌症致死的患者中占2 。据估计，在2 0 0 0 年美国有3 1 2 0 0人诊断为膀虢癌，1 2 2 0 0 人死于此病。膀胱癌的复发性和浸润性是影响治疗预后的主要原因。随着分子生物学的发展及其在肿瘤中的应用，现认为肿瘤发生机制主要是原癌基因的激活和
6、抑癌基因的失活导致细胞增殖失控及凋亡缺陷，所以，肿瘤被视为一种基因疾病。纠正肿瘤细胞中异常基因的行为，抑制癌基因的过度表达，增强抑癌基因的功能，将从分子水平治疗肿瘤。近年来的研究表明，膀胱癌有染色体的遗传学改变，等位基因缺失常见于4 p ，8p 9 p ，9 q ，1 0 q ，l l p 和1 7 p 等，已经确认p 5 3 和p 1 6 为抑癌基因。最近，在肿瘤中同源性缺失的1 0 q 2 3 3 位基因披克隆出来，被命名为P T E N 。这个基因具有如下特点：1 在多种高分级癌中有突变。2 具有磷酸酶活性，与张力蛋白同源。3 在上皮细胞内富含且能被T G F B 调控。研究发现，P T
7、 E N 在多种肿瘤中有突变和缺失，包括恶性黑色素瘤、脑肿瘤、乳腺癌、子宫内膜癌、前列腺癌、甲状腺癌、卵巢癌、胰腺癌、结肠癌、膀胱癌和头颈肿瘤等。P T E N被认为是一种新的抑癌基因，它具有双特异磷酸酶活性，能使作用底物的丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸去磷酸化调控细胞内信号传导通路。P T E N 能够调控很多细胞的生长、粘附、迁移、浸润和凋亡等。P T E N 在膀胱癌的研究目前刚刚开始，国外仅有P T E N 在膀胱癌突变的报道，国内还无人涉及。2天津区科大学博士学位砼文本课题用外源性野生型P T E N ( W T P T E N ) 、突变型P T E N ( D N P T E N )质粒
8、对膀胱癌细胞系E J 进行转染，达到基因治疗的目的，初步研究了P T E N基因对膀胱肿瘤细胞生物学的影响，并将基因治疗与化学治疗联合治疗肿瘤，探讨了其临床应用价值。通过检测膀胱肿瘤组织中P T E N 第5 外显子、第8 外显子的突变证明了P T E N 突变在膀胱癌中不是一个常见事件。通过检测膀胱肿瘤组织中P T E N 、B c l 2 的表达，研究了P T E N 、B c l 一2 在膀胱癌的表达特点。本课题的完成，较为系统地研究了P T E N 基因在膀胱癌细胞的独特作用，为以P T E N 进行膀胱癌的基因治疗奠定了基础。第一部分w T P T E N 对膀胱癌细胞生物学行为影响
9、的研究实验采用含有磷酸酶活性的w T P T E N c D N A 质粒p S v E G F P P T E N 、磷酸酶灭活的P T E N 突变体p S v E G F P C 1 2 4 A 质粒及p S v E G F P 空载质粒，这三种质粒均没有抗生素抗性。另一个质粒为p - I R S E V e c t o r 空载质粒含A m p和H y g 抗性。这四个质粒经过体外扩增并纯化，用脂质体转染法，利用脂质体L i p o f e c t A M I N 分别将P I R S E - V e c t o r 与p S v E G F P P T E N 、p S v E G
10、F P C 1 2 4 A 、p S v E G F P 共转染人膀胱癌细胞系E J 中，经H y g 筛选出有绿色荧光的阳性细胞克隆，将其命名为E J p S v E G F P - P T E N ( W T - P T E N ) 、E J p S v E G F P - C12 4 A( D N P T E N ) 、E J p S v E G F P ( V E C ) 。通过免疫组化检测细胞浆P T E N 蛋白的免疫原性和W e s t e r nb l o t 方法检测细胞克隆的P T E N 蛋白水平，发现E J D s v E G F P P T E N 、E J p S
11、v E G F P C 1 2 4 A 增加了P T E N 蛋白水平表达，E J p S v E G F P 没有变化，证明p S v E G F P - P T E N 、p S v E G F P C 1 2 4 A 质粒在E J细胞内有效表达。通过观察E J p S v E G F P P T E N 、E J p S v E G F P C 1 2 4 A 、E J - p S v E G F P 和E J细胞的生长情况，发现转染w T P T E N 的E J p S v E G F P P T E N 的生长速度减慢，第6 天时，下降了4 2 7 ( P 0 0 5 ) 。以M
12、T T 法检测细胞增殖率，发现天津医科大学博士学位论文第2 天开始转染外源性w T P T E N 基因的细胞克隆生存活力明显低于对照空载体组、E J 和E J p S v E G F P C 1 2 4 A 组( 均P O 0 5 ) C l o n e sw i t hh i g he x p r e s s i o no fW T P T E Ns h o w e dd e c r e a s e dp r o l i f e r a t i o nt h a no t h e rc e i l sb yM T Tm e t h o d ，a n di tr e d u c e db y
13、4 0 11 ( P 0 0 5 ) T h ed a t as u g g e s t e dt h a tP T E Nc o u l di n h i b i t e dt h eg r o w t ho fc a n c e rc e l l s T h eG 0 G1s t a g er a t i o si nE J p S v E G F P P T E Nc e l lw e r eh i g h e rt h a nE J p S v E G F P C12 4 A ，E J p S v E G F Pa n dE Jc e l l s ，s i m u l t a n e
14、o u s l y , t h eSs t a g er a t i o sw e r el o w e rt h a nt h eo t h e rg r o u pc e l l s F l o wc y t o m e t r i ca n a l y s i so ft h ec e l lc y c l er e v e a l e dt h a tP T E Nc o u l dr e s t r a i nt h eg r o w t ho fe a n c e rc e l l sb ，7t h ei n h i b i t t i n gt h eG 1t oSt r a n
15、 s i t i o n T h em e c h a n i s mm a yb er e l a t e dw i t hP 1 3 K A k ts i g n a l i n gp a t h w a y S m a l l e rc e l ls i z ea n dl o w e ra b n o r m i l yw e r es e e ni nE J p S v E G F P - P T E N( c o m p a r e dw i t hE J ) u n d e rl i g h tm i c r o s c o p e ，w h i l ec h a n g e s
16、o fu l t r a s t r u c t u r ei n c l u d e dp e r i p h e r a la c c u m u l a t i o no fn u c l e a rc h r o m a t i n ，f r a g m e n t a t i o no fn u c l e u sa n dc l e a ra p o p t o s i sb o d y E J p S v E G F P C12 4 As h o w e dm o r ea g g r e s s i v ec e l l sw i t h o u ta p o p t o s i s T h eu n t r a n s f e c t e dE Jc e l l sa n dE J p S v E G F Pc e l l st r a n s f e c t e dw i t he m p t yv
