常用细菌检测方法

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1、中心以化工行业技术需求和科技进步为导向，以资源整合、技术共享为基础，分析测试、技术咨询为载 体，致力于搭建产研结合的桥梁。以“专心、专业、专注“为宗旨，致力于实现研究和应用的对接，从而推 动化工行业的发展。 科标化工分析检测中心致力于推动化工产业发展，欢迎各行同仁前来洽谈、合作。常用细菌检测方法常用细菌检测方法一、3H脱氧胸苷摄入法测定细胞数：1、用 RPMI-1640 培养液洗涤对数生长期（培养 3 天）的 CTLL-2 细胞两次，每次 250g 离心10 分钟，洗去培养液中残存的 IL-2。2、 用台盼蓝（ 1% Trypan blue） 染色法计数细胞并决定细胞的活力 ，用 10%小牛血

2、清的 RPMI-1640培养液悬浮细胞至 1105/ml。3、 在 96 孔细胞培养板中每孔加 0.1ml 倍比稀释的标准 IL-2 或待测样品， 每个稀释度三个复孔，标准 IL-2 从 40 IU/ml 稀释到 0.019 IU/ml（810 个稀释度） ，阴性对照孔不加 IL-2。4、每孔加 0.1ml 细胞悬液，在 37 5% CO2 的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养 1824 小时。每孔加 10l（0.5Ci 或 1.85104Bq）3H脱氧胸苷，继续培养 4 小时。5、用多头细胞收集器将细胞收集到玻璃纤维滤纸上，用 3%醋酸水溶液滤纸 3 次，洗去游离的3HTdR。将滤纸置液体闪烁瓶中

3、，加入 5ml 闪烁液。在液体闪烁仪上计数细胞摄入的同位素活性（每分钟放射性计数，cpm） ，根据仪器效率换算成 dpm（每分钟衰变数） 。6、用 dpm 值对样品稀释倍数作图。在图上，标准 IL-2 的曲线与待测样品的曲线应当呈平行的S 型，说明是同样的分子反应。比较同样 dpm 处的不同稀释倍数，决定待测样品的相应浓度。二、MTT 检测法：1、取 96 孔细胞培养板，每孔中加 0.1ml 含 210410104 靶细胞的培养液（含 10%小牛血清的 RPMI-1640 培养液） ，在 37 5% CO2 的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养 23 小时让细胞帖壁（如果是悬浮细胞可直接进行下一步）

4、2、用 RPMI-1640 培养液 210 倍递次稀释细胞因子标准品，根据情况 25 倍递次稀释待检样品，每孔加 0.1ml 稀释的标准品和待检样品，每个稀释度 3 个重复孔。对照孔 6 个：3 个阳性对照孔，每孔加 0.1ml 含大剂量细胞因子的 RPMI-1640 培养液，3 个阴性对照孔，每孔加 0.1mlRPMI-1640 培养液。在 37 5% CO2 的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养 2448 小时或预定的时间。3、吸去培养液，用 PBS 洗涤一次（如为悬浮细胞，应在吸去上清液前离心培养板） 。中心以化工行业技术需求和科技进步为导向，以资源整合、技术共享为基础，分析测试、技术咨询为载

5、 体，致力于搭建产研结合的桥梁。以“专心、专业、专注“为宗旨，致力于实现研究和应用的对接，从而推 动化工行业的发展。 科标化工分析检测中心致力于推动化工产业发展，欢迎各行同仁前来洽谈、合作。4、 每孔加 0.1ml PBS 和 10l MTT 染液，在 37 5% CO2 的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养 46 小时。5、每孔加 0.1ml 酸化异丙醇，也可用含 10% SDS 的 10mmol/L HCl 代替酸化异丙醇，在振荡器上振荡混匀，让还原产物充分溶解。置酶联检测仪上测定光密度（OD）值，检测波长 570nm，参考波长 630nm。以 OD 值对样品稀释度作图，比较标准曲线和待测样品曲

6、线即可求得待测样品中细胞因子的含量。三、XTT 检测法：用 XTT 代替 MTT 可省去溶解还原产物结晶的步骤，XTT 可以被活细胞中的代谢酶还原成黄色水溶性的代谢产物（formazan） 。代谢产物在 OD450 处有吸收峰。四、MTS 检测法：1、培养 IL-2 依赖细胞株 CTLL-2 细胞或 HT-2 细胞（检测 IL-2） ，或者 IL-3 依赖细胞株 FDC-P1细胞或 FL5.12 细胞（检测 IL-3）到对数生长期。2、 取 96 孔细胞培养板， 每孔加 0.1ml 含 11042104 上述细胞之一的 DMEM 培养液 （加 10%小牛血清） 。3、每孔加 0.1ml 系列稀

7、释的待测细胞因子（IL-2 或 IL-3）样品或细胞因子标准品，在 37 5%CO2 的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养 24 小时。4、每孔加 20l MTS/PMS 混合液，继续培养 34 小时显色。5、检测前摇晃培养板 10 秒钟，混匀颜色。在酶联检测仪上，波长 570nm（或 490nm，或 570nm和 690nm） 处检测各孔的光吸收值 （OD） 。 用样品稀释度对 OD 值 （OD570、 OD490 或 OD570/OD690）绘制剂量-反应曲线，根据标准品曲线计算样品中细胞因子的量。五、NAG 检测法：1、按 MTT 检测法培养细胞和用不同稀释度的细胞因子处理细胞。2、吸去培养液

8、，用 PBS 洗涤两次（如为悬浮细胞，应在吸去上清液前先离心） 。3、每孔加 60l NAG 染液，在 37 5% CO2 的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养 4 小时。4、每孔加 90l 终止液，混匀后置酶联检测仪上测定光密度（OD）值，检测波长 402nm。以 OD值对样品稀释度作图，比较标准曲线和待测样品曲线即可求得待测样品中细胞因子的含量。中心以化工行业技术需求和科技进步为导向，以资源整合、技术共享为基础，分析测试、技术咨询为载 体，致力于搭建产研结合的桥梁。以“专心、专业、专注“为宗旨，致力于实现研究和应用的对接，从而推 动化工行业的发展。 科标化工分析检测中心致力于推动化工产业发展，欢

9、迎各行同仁前来洽谈、合作。六、AlamarBlueTM 摄入法：1、按 MTT 检测法培养细胞和用不同稀释度的细胞因子处理细胞。2、在培养结束前 24 小时加入 Alamar Blue 染料，96 孔细胞培养板每孔 20l。3、在培养结束后，直接在酶联检测仪上测定光吸收值。氧化型Alamar Blue 的最大光吸收在570nm， 用 OD570 减去 OD600 即为活细胞还原的 Alamar Blue 染料， 颜色深浅与活细胞数成正比。七、碱性磷酸酶检测法（AKP 法） ：1、按 MTT 法用细胞因子处理靶细胞适当时间，用 PBS 洗去死亡细胞，洗两次。2、向 96 孔细胞培养板各孔中加 0

10、.2ml 新鲜配制的底物液（0.2mol/L 硼酸，1mmol/L MgCl2，1.2mmol/L 甲伞基磷酸） 。在 37 5% CO2 的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养 3 小时。3、在荧光计数仪上测定荧光的量。根据测定已知不同数目细胞的荧光量作出标准曲线，根据标准曲线可得到各孔中的活细胞数。八、三磷酸腺苷检测法（ATP 法） ：1、ATP 反应液（Bio-Orbit）是粉末状混合物，含有荧光素、荧光素酶、0.5mmol 醋酸镁、50mgBSA 和 0.1mol 无机焦磷酸。 在 4可以保存 1 个月。 用前用 10ml 含 2mmol/L EDTA 的 0.1mol/LpH7.75 Tri

11、s-醋酸缓冲液稀释。稀释液分装后可在20长期保存。2、在已经完成促增殖或抑生长试验后的 96 孔细胞培养板中（每孔含 100L 细胞培养液） ，每孔加 0.1ml ATP 释放因子，室温中反应 5 分钟。取另一块 96 孔细胞培养板，从第一块板的各孔中吸 0.1ml 细胞溶解物到第二块板的相应各孔。3、在低于 25中，将第二块板置自动多孔荧光检测仪中。用自动加样器，每孔加入 20l ATP反应液，立即检测 10 秒钟的荧光强度。温度升高，检测敏感性就下降。4、用 RLU（Y 轴）对细胞因子标准品的稀释度（X 轴）作标准曲线，根据标准曲线确定待测样品中细胞因子的含量。九、染料染色法测定细胞数：1

12、）结晶紫检测法：1、在 96 孔细胞培养板各孔中加 0.1ml 含 5104104 WEHI-164 细胞的培养液（含 10%小牛血清的 RPMI-1640 培养液） ，37 5% CO2 的二氧化碳培养箱中培养 23 小时，让细胞帖壁。中心以化工行业技术需求和科技进步为导向，以资源整合、技术共享为基础，分析测试、技术咨询为载 体，致力于搭建产研结合的桥梁。以“专心、专业、专注“为宗旨，致力于实现研究和应用的对接，从而推 动化工行业的发展。 科标化工分析检测中心致力于推动化工产业发展，欢迎各行同仁前来洽谈、合作。2、用 RPMI-1640 培养液 10 倍递次稀释 TNF 标准品，根据需要 3

13、5 倍递次稀释待检样品，每孔加 0.1ml 稀释的标准品或待检样品，每个稀释度 3 个重复孔。对照孔 6 个，3 个阳性对照孔各加 0.1ml 含 4g TNF 的 RPMI-1640 培养液，3 个阴性对照孔各加 100l RPMI-1640 培养液。继续培养 1824 小时。3、甩去培养液，用 PBS 小心洗涤一次，每孔加 0.1ml 10%甲醇溶液固定细胞 30 秒钟。4、吸去甲醇溶液，每孔加 0.1ml 结晶紫染液，室温中放置 20 分钟。5、轻轻甩去染色液，用蒸馏水洗涤各孔，将培养板倒置于吸水纸上吸干水分。自然干燥或 37烘干。此板可以在室温中长期保存。6 、测定前， 每孔加 0.1

14、ml 33%醋酸脱色， 充分振荡后在 570nm 处测定光吸收度。 用光吸收度（ OD）值对样品稀释度作图，比较标准品曲线和待检样品曲线即可得到待测样品中的细胞因子活性2）NBB 检测法：1、在用细胞因子处理靶细胞以后倾去培养液，倒置培养板于吸水纸上吸干培养液。再用 100l 磷酸缓冲盐水小心洗去死细胞，用吸水纸吸干培养液。2、每孔加 100l NBB 染液，室温中染色 30 分钟。轻轻染液。用吸水纸吸干染液。3、每孔加 100l 福尔马林固定液固定 15 分钟。用自来水轻轻洗去固定液，倒置培养板，用吸水纸吸干染液。4、每孔加 150l 50mmol/L 氢氧化钠。轻轻振荡培养板直到染料全部溶

15、解并均匀分布。在分光光度计上读取各孔在 620nm 处的光密度（OD）值。计算 TNF 的活性。3）美蓝染色检测法：1、用细胞因子处理靶细胞，在含 100L 细胞培养液的检测孔中，每孔加 0.02ml 25%戊二醛固定活细胞 15 分钟，用自来水缓缓洗去死细胞和固定液。2、每孔加 0.1ml 0.05%美蓝染液，染色 20 分钟，用自来水缓缓冲净染液，晾干。3、每孔加 0.2ml 0.33mol/L 盐酸溶解美蓝，振荡混匀。在 665nm 波长处测定光吸收度。计算TNF 的活性。4）中性红染色检测法：1、用细胞因子处理靶细胞，在含 100L 细胞培养液的检测孔中，每孔加 50l 5%中性红染液

16、。中心以化工行业技术需求和科技进步为导向，以资源整合、技术共享为基础，分析测试、技术咨询为载 体，致力于搭建产研结合的桥梁。以“专心、专业、专注“为宗旨，致力于实现研究和应用的对接，从而推 动化工行业的发展。 科标化工分析检测中心致力于推动化工产业发展，欢迎各行同仁前来洽谈、合作。继续培养 2 小时。2、小心倒去培养液。用 200l Hanks 液洗涤细胞 1 次。小心倒去培养液，减少细胞丢失。3、每孔加 100l 脱色液，在摇床中轻轻摇晃溶解 30 分钟。在 550nm 波长处测定 OD 值。十、直接计数细胞：1、如果靶细胞是帖壁细胞，在细胞因子作用适当时间后，用生理盐水洗去死亡细胞，用 0.25%胰蛋白酶液消化细胞。加适量生理盐水吹打，使细胞分散成单个细胞。直接在血细胞计数板上计数细胞。2、如果靶细胞是悬浮细胞，则需要用染色剂区分死细胞和活细胞然后再计数。通常用台盼蓝染色细胞，活细胞可以排除进入细胞的台盼蓝而不着染，死细胞着染呈深蓝色。3、计数血细胞计数板上