《流式细胞仪原理及应用 简介》由会员分享，可在线阅读，更多相关《流式细胞仪原理及应用 简介（37页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、流式细胞仪原理流式细胞仪原理与与应用应用FLOW CYTOMETRY (FCM)Presented by Hao Sha 10-13-2012一、一、FCM概况概况二、基本构造和原理二、基本构造和原理三、实验中注意事项三、实验中注意事项一、一、FCM概述概述流式细胞仪流式细胞仪(Flow Cytometer，FCM): 是集合光电子物理、光电测量技术、液流技术、计算机技术等现代高科技技术为一体的细胞测量和分析仪器。流式细胞术流式细胞术（Flow cytometry，FCM）以流式细胞仪为主要工具，对处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒细胞的各种成分进行多参数、快速的定量分析和分选的技术。特点
2、特点: :单细胞，也能区分群体细胞单细胞，也能区分群体细胞可分析小于可分析小于1/100001/10000比例的稀有细胞群、单细胞克隆等；比例的稀有细胞群、单细胞克隆等；定量的定量的多参数测量和分析（散射光和荧光，可多达多参数测量和分析（散射光和荧光，可多达2727色）色）快速测量和分析（每秒可达快速测量和分析（每秒可达10001000- -1000010000个细胞）个细胞）分选细胞的高纯度（可达分选细胞的高纯度（可达99%99%）；FCM的特点和优势的特点和优势流式细胞仪的测量对象大小大小0.2300um对象类型对象类型细胞类型：（1）高等真核细胞;（2）酵母；（3）细菌;（4）多细胞的聚
3、集体，如胰岛等非生命颗粒：细胞核、染色体、其它细胞器以及乳化微球等。流式细胞仪的类型临床型小型，科研与临床结合型。科研型大型，基础研究和加速分选型。新型流式细胞仪27根激光管，可检测27个参数。高速分选，50000个/sec。目前国内主要流式细胞仪厂家：目前国内主要流式细胞仪厂家：Beckton Dickinson(BD)公司公司BACKMAN COULTER公司公司流式细胞仪图片BD FACSCaliburLSR IIBD InfluxBD FACSC Aria IIBD Accuri C6用一定压力将待测样 品压入流动室，不含细胞的缓冲液在高压下从鞘液管喷出，包绕着样品单行排列并高速流动，
4、依次通过检测区域。以激光作为发光源，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。二、基本原理和构造基本构造基本构造1 1） FluidicsFluidics SubsystemSubsystem保证细胞单个通过检测区2 2）OpticsOptics SubsystemSubsystem: : excitationexcitation componentscomponents使检测细胞发出继发荧光OpticsOptics subsystemsubsystem: : collectioncollection componentscomponents规范散射光、继发荧
5、光3 3）ElectronicsElectronics subsystemsubsystem将光信号转化为电信号，使检测结果完美的表达出来4 4）SortingSorting subsystemsubsystem保证细胞的分选功能构造模式图流动室及液流驱动系统流动室及液流驱动系统激光光源及光束形成系统激光光源及光束形成系统光学系统光学系统1、 Fluidics SubsystemFluidics Subsystem 流动室与液流驱动系统 流动流动室：室：核心核心部部件件，样品在此与激光相交；，样品在此与激光相交； 液流层流原理：液流层流原理：鞘液（鞘液（PBS或去离子水）或去离子水），使流动细
6、胞拉开，使流动细胞拉开 距离，单个细胞通过；距离，单个细胞通过； 要求分辨率高的样品（要求分辨率高的样品（DNA）应用低速：周期）应用低速：周期Injector TipFluorescence signalsFocused laser beamSheath fluid液流与流速控制2、光学系统：激光光源及光束成形系统 excitation componentsexcitation components激光：激光：一般选配24跟激光，如355nm355nm，405nm405nm，488nm488nm，633nm633nm等；等；国内最多6激光27色，国外最多7激光。激光光束在到达流动室前，先经过
7、透镜聚焦，形成约2266m的光斑，这样激光能量较强，以激发荧光染料。LSR II：355nm，405nm，488nm，633nmInflux： 355nm，405nm，457nm，488nm，532nm，561nm，640nm3、光学系统： collection componentscollection components 由若干组透镜、滤光片和小孔组成，它们将不同波长的荧光信号分别送入到不同的电子测控器。 主要光学原件：滤光片(Filter) 长通滤片 Long Pass Filter, LP（ 500nm） 650/60 短通滤片 Short Pass Filter, SP（500nm）
8、 带通滤片 Band Pass FilterBP（450550nm ）光学系统的结构光学系统的结构LSR IIAria IIIInflux355nmDAPI/Hoechst*375nm*405nmPacific Blue Alexa Fluor430 BD Horizon V450488nmFITC Alexa Fluor488*PE*PI/PE-Texas Red*PE-Cy5* *PerCP-Cy5.5 PerCP/7-AAD*PE-Cy7*561nm*633nmAPC Alexa Fluor 647*Alexa Fluor700*APC-Cy7 APC-H7 Alexa Fluor780
9、*4、 Electronics subsystemElectronics subsystem 信号检测与分析光信号PMT电信号散射光信号 散射光信号不依赖任何样品的制备技术，物理参数。FSCFSC(Forward Scatter)前向散射角：反应细胞大小和 表面积，在FCM应用中，常取FSC作阈值，来排除样品 中的各种碎片。SSCSSC (Side Scatter) 侧向散射角：与激光束正交90度 的散射光信号，与细胞粒度及复杂程度正相关。 散射光信号波长与激光相同。荧光信号 自发荧光 特征荧光：一种是经过特异荧光素标记后，受激发光照射 得到的荧光信号。散射光散射光荧光荧光（一）免疫荧光标记最
10、常用的荧光染料（一）免疫荧光标记最常用的荧光染料荧光染料荧光染料激发波长（激发波长（nm) 发射波长（发射波长（nm) 颜色颜色FITC 488 525 深蓝色PE(RDI) 488 575 橙色ECD 488 620 橙红色PeCy-5 488 670 红色PeCy-7 488 755 深红色PI 488 620 橙红色APC 633 670 红色APC Cy7 633 670 能量传递染料：能量传递染料：用化学法将两种不同激发波长的染料结合在一起，在用化学法将两种不同激发波长的染料结合在一起，在488nm波长激发波长激发光激发后产生的发射波长激发另一荧光染料产生的荧光信号。光激发后产生的发
11、射波长激发另一荧光染料产生的荧光信号。LaserCY7488nm PECY7CY7荧光信号的线性测量与对数测量：荧光信号PMT电信号放大器放大器：线性放大（lin）：DNA、RNA、protein对数放大（log）：细胞膜表面抗原荧光信号的面积和宽度：FL2FL2- -A,FL2A,FL2- -W W光谱重叠的校正：补偿补偿两色以上荧光分析存在两色以上荧光分析存在 光谱交叉光谱交叉所有补偿调为 “0”调节电压，用同 型对照或阴性对 照，使阴性群位 于“左下角”依单阳群体调节 荧光补偿FCM测量数据的存贮、显示和分析数数据的显示常用以下几种方式据的显示常用以下几种方式：5、SortingNozz
12、le and sheath pressureSort gateSort mode分选指标：效率、纯度和得率分选指标：效率、纯度和得率三、实验中注意事项三、实验中注意事项1、样品准备1）原代细胞（骨髓、血液）；2）培养的细胞单细胞悬液：上机前过膜单细胞悬液：上机前过膜2、染色1）荧光染料的选择：荧光强弱2）多色搭配：激发光和发射光谱3）染色条件：抗体浓度、冰上/4度，避光4）同型对照，阴性对照，单阳管非常用组合非常用组合 PE-texas red/PI PE PE-Cy5 Percp-Cy5.5/Percp PE-Cy5 APCFITCPEPerCP-Cy5.5PE-Cy7PerCP-Cy5.5
13、APCPE-Cy7PEPE-Cy7APC-Cy7APC Alexa Fluor700APC-CY7补偿补偿http:/ events /s 30005000/s 检测DNA含量时应低速分选：12107cell/ml ，10000 events/s左右2）阈值：默认5000，我一般用25000，去除碎片 （骨髓和血液）3）设门4）补偿：两两之间，补偿一般应205）数据保存：experiment and FCS6）模板保存，数据及时拷走备份7）数据分析：BD Diva 和 Flowjow3、仪器清洗分析：洗液1外管15s，内管10min洗液2 外管15s，内管10minddH2O 外管15s，内管10min如果有人继续测，ddH2O，standby。分选：洗液12030minddH2O30minProtocol BD ebioscience biolegend Nature protocol谢谢！谢谢！
