高效液相色谱-质谱联用法检测

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1、D O I:1 0. 3 7 2 4/S P. J . 1 0 9 6. 2 0 1 2. 1 1 1 3 5高效液相色谱-质谱联用法检测 免疫抑制剂及其合并用药李鹏飞1 王 燕2 张 征1 童卫杭2 吴 华1 马 萍2 王 静2 刘丽宏* 11( 北京朝阳医院药事部,北京 100043)2( 第二炮兵总医院药剂科,北京 100088)摘 要 建立高效液相色谱-质谱联用法同时测定人血浆中免疫抑制剂及合并用药 12 种药物浓度的方法。选用Kromasil-C18色谱柱( 50 mm4.6 mm5 mm) , 以甲醇-乙腈-1 mmol/L 乙酸铵溶液为流动相, 采用梯度洗脱进行分离, 样本用甲醇

2、沉淀蛋白后进样, 流速: 1.1 mL/min; 柱温:35; 进样量: 20 mL。选用 3200QTrap 型液相色谱-串联质谱仪的多反应监测( MRM) 扫描方式进行检测。12 种药物的线性范围为 0.21000 mg/L; 定量下限为0.2 mg/L。准确度与精密度结果显示方法日间、 日内 RSD 均小于 15% ; 相对偏差-13%9.33% , 稳定性较好。本方法快速、 灵敏, 专属性强、 重现性好, 可用于人体血浆中免疫抑制剂及其常用合并用药共 12 种药物浓度的测定。关键词 高效液相色谱-质谱联用法; 免疫抑制剂; 联合用药2011-10-09 收稿; 2012-05-03 接

3、受 本文系首都医学发展科研基金( No.2007-1016) 资助 *E-mail: 1 引 言免疫抑制剂是一类通过抑制细胞及体液免疫反应, 而使组织损伤得以减轻的化学或生物物质。目前广泛应用于器官移植抗排斥反应和自身免疫性疾病的治疗。常用的免疫抑制剂主要有: 糖皮质激素类( 氢化可的松、 泼尼松、 泼尼松龙、 甲泼尼龙、 地塞米松、 可的松、 强地松等) 、 微生物代谢产物( 环孢菌素A、 他克莫司、 西罗莫司( 雷帕霉素) 、 依维莫司等) 、 抗代谢物( 硫唑嘌呤、 6-巯基嘌呤等) 、 霉酚酸酯等1。环孢菌素 A( CsA) 与他克莫司( FK506) 在临床应用中需要进行治疗药物监测

4、已是大家的共识, 其测定值作为临床评价疗效及毒性反应的指标。以 CsA 和 FK506 为代表的第二代免疫抑制剂, 为细胞因子合成抑制剂, 主要作用是阻断免疫活性细胞的白细胞介素 2 的效应环节, 干扰细胞活化, 绝大部分分布于红细胞, 血浆药物浓度与全血药物浓度不相关, 临床需监测全血样本, 国内外文献25和本实验室69已有多篇相关全血浓度监测方法的报道。糖皮质激素、 抗代谢物和霉酚酸酯作为临床常用免疫抑制方案的成分, 其血浆药物浓度与疗效和毒性有相关性, 且与常用免疫抑制剂 CsA 和 FK506 在体内有协同或拮抗作用, 已有文献提出需进行血药浓度监测1。此外, 在其它合并用药中尼卡地平

5、、 非洛地平、 地尔硫卓和奥美拉唑等对 CsA 和 FK506 均有协同作用。因此, 本研究建立了血浆中糖皮质激素、 抗代谢物、 霉酚酸酯等常见免疫抑制剂及常见合并用药 LC-MS/MS 同时定量检测方法, 不仅能为进一步验证免疫抑制剂与常用合并用药的相互作用提供方法支持, 也为进一步深入开展个体化使用免疫抑制剂提供技术方法, 从而更好地服务于临床。2 实验部分2. 1 仪器与试药 3200 QTrap 型液相色谱-串联质谱仪( 美国 Applied Biosystems 公司) , 配有电喷雾离子化源( ESI) 以及 Analyst 1.4.2 数据处理软件; Agilent1100 高效

6、液相色谱系统( 美国 Agilent 公司) , 包括四元输液泵、 自动进样器、 柱温箱、 切换阀。硫唑嘌呤( 纯度 99% , 批号 100197-199601) 、 6-巯基嘌呤( 纯度 89.4% , 批号 100039-200602) 、 泼尼松( 纯度 99% , 批号 100199-199401) 、 泼尼松龙( 纯度 99% , 批号 100153-199603) 、 甲基泼尼松龙( 纯度 99% ,批号 10028-200501) 、 氢化可的松( 纯度 99% , 批号 100152-200206) 、 地塞米松( 纯度 99.6% , 批号 100129-第 40 卷201

7、2 年 10 月分析化学 ( FENXI HUAXUE) 研究报告Chinese Journal of Analytical Chemistry第 10 期15731578200804) 、 奥美拉唑( 纯度 99% , 批号 100367-200702) 、 地尔硫卓( 纯度 99% , 批号 100161-200503) 、 尼卡地平( 纯度 99.4% , 批号 100586-200401) 、 非洛地平( 纯度 99% , 批号 100717-200501) 的对照品均购自中国药品生物制品检定所; 霉酚酸对照品( 纯度 98% ,批号 028K2572) 购自 Sigma 公司; 替米

8、沙坦( 纯度为 99.8% ,批号 M060601) 内标购自广州清平制药有限公司; 甲醇、 乙腈为色谱纯, 其它试剂均为分析纯, 空白人血浆由第二炮兵总医院提供。2. 2 色谱-质谱条件 Kromasil-C18柱( 50 mm4.6 mm5 mm) ; 流动相:甲醇-乙腈-1 mmol/L 乙酸铵溶液, 梯度洗脱( 梯度条件见表 1) ; 流速: 1.1 mL/min; 柱温:35; 进样量:20 mL。表 1 梯度条件 Table 1 Conditions of gradient elution时间 Time ( min)乙腈 Acetonitrile ( % )1 mmol/L 乙酸铵

9、 Ammonium acetate ( % )甲醇 Methanol ( % )时间 Time ( min)乙腈 Acetonitrile ( % )1 mmol/L 乙酸铵 Ammonium acetate ( % )甲醇 Methanol ( % )0.00090103.50764200.10090104.90764200.801020704.91090101.203010607.00090101.5072820电喷雾离子化源, 正离子化模式; 离子喷射电压: 5.5 kV; 温度: 570; 源内气体 1( GS1, N2) 压力: 310 kPa; 气体 2( GS2, N2) 压力:

10、 331 kPa; 气帘气体( N2) 压力: 138 kPa; 扫描方式为多反应监测( MRM) ; 碰撞气( N2) 压力: 中等( Medium) ; 各药物及内标替米沙坦的定量离子对及主要质谱参数见表 2。表 2 质谱参数 Table 2 MS parameters编号 No.化合物 Compund离子对 Ion pair (m/z)碰撞能量 Collision energy ( eV)锥孔电压 Cone voltage ( V)16-巯基嘌呤 6-Mercaptopurine153.292.04350153.2119.1*32502硫唑嘌呤 Azathioprine278.2142.

11、2*1520278.2232.218203霉酚酸 Mycophenolic acid321.3207.2*2540321.3303.312404奥美拉唑 Omeprazol346.4136.34430346.4198.2*14305泼尼松 Prednisone359.2147.2*3545359.2313.218456泼尼松龙 Prednisolone361.3147.23030361.3325.3*14307氢化可的松 Hydrocortisone363.3121.1*3560363.3327.322608甲泼尼龙 Methylprednisolone375.3161.23225375.33

12、39.4*13259非洛地平 Felodipine384.2338.21725384.2352.2*142510地塞米松 Dexamethasone393.3237.22519393.3355.2*151911地尔硫卓 Dilthiazem415.3150.26230415.3178.2*343012尼卡地平 Nicardipine480.491.28045480.4315.2*324513替米沙坦 Telmisartan515.1276.1*5035*定量离子对( Quantification ion pair) 。4751 分 析 化 学第 40 卷2. 3 血浆样本处理 移取血浆样本 1

13、00 mL 于 1.5 mL EP 管中, 加入含内标的甲醇溶液 300 mL, 涡旋 30 s、 离心 5 min( 13200 r/min) , 取上清液, 进样 20 mL。3 结果与讨论3. 1 免疫抑制剂及常见合并用药选择 免疫抑制剂及常见合并用药主要是根据临床血药浓度监测需求确定的, 合并用药主要针对常见并发症中合并用药对免疫抑制剂浓度有影响的药物。以 CsA 和 FK506 为代表的第二代免疫抑制剂需监测全血药物浓度, 与其它免疫抑制剂及常见合并用药在前处理方法上不兼容, 且有多篇报道, 因而未再进行 CsA 和 FK506 方法探索。霉酚酸酯和可的松均属于前药, 本研究针对临床

14、有活性的霉酚酸和氢化可的松进行定量检测方法的开发。强的松在临床上已很少使用, 生物制剂多克隆和单克隆抗淋巴细胞抗体( 如抗淋巴细胞球蛋白和 OKT3 等) 和烷化剂类( 如环磷酰胺等) 不适宜进行 LC-MS/MS 测定。3. 2 质谱和色谱条件的优化 用甲醇-乙腈( 11,V/V) 将各药物的储备液分别稀释成 10 mg/L 的溶液, 用蠕动泵模式进样, 首先进行 Q1 全扫描( Full scan) 采集信号, 得到一级质谱图; 然后依次将母离子经过电子碰撞后击碎, 对目标化合物的母离子进行子离子扫描, 得出子离子质谱图, 确定子离子, 相应的二级全扫描质谱图见图 1。实验过程中对每种药物

15、均选用正、 负两种离子模式进行实验, 结果表明, 只有霉酚酸负离子模式优于正离子模式, 其它药物均为正离子模式优于负离子模式, 综合 12 种药物最终选用正离子模式。在所有药物中, 由于非洛地平含有两个氯原子, 同位素峰特别明显。对色谱柱、 流动相、 梯度、 柱温、 进样量进行了考察。分别选用长度为 15 和 5 cm 的色谱柱进行实验, 由于实验要同时检测 12 种药物, 所用时间较长, 为了节省时间, 本研究选用 5 cm 短柱。对于流动相, 水相分别考察了乙酸铵、 0.1% 甲酸及二者的混合溶液, 其中乙酸铵浓度分别考察了 1, 2 和5 mmol/L,水相最终选用 1 mmol/L 乙

16、酸铵; 有机相分别考察了甲醇及乙腈, 实验表明, 前半部分出峰的药物在甲醇中出峰较好, 后半部分在乙腈中出峰较好, 最终确定了一个有机相先高甲醇后高乙腈的 7 min 的梯度。柱温分别考察了 20, 25, 30 35, 40, 45 和 50, 综合考虑 12 种药物公离效果, 最终选用 35。进样量最终确定为 20 mL。典型的离子流图见图 2。3. 3 生物样本前处理方法的优化和内标的选择 实验过程中分别尝试了固相萃取法、 液-液萃取法、 蛋白沉淀法 3 种前处理方法。由于硫唑嘌呤和6-巯基嘌呤的极性较大, 在 SPE 柱上保留较差, 故未采用固相萃取法。同时, 由于在 12 种药物中, 有些药物极性较大, 有些极性很小, 极性相差太大, 所以也不适宜用液-液萃取进行生物样本前处理。本实验选用蛋白沉淀法, 此方法中药物不需要进行转移, 过程简单、 快速。对比甲醇、 乙腈作为沉淀试剂的检测结果, 选用甲醇作为沉淀剂。沉淀蛋白回收率不足 100%