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1、199mTc 示踪法初步研究注射 NGF 家兔药代动力学作者：付昌文，吕天润，曹小建，刘 军【摘要 】 目的 使用 99mTc 示踪初步研究注射用 NGF 在家兔体内药代动力学。方法 将 NGF 用 99mTc 标记，利用同位素示踪法和 TCA 沉淀法测得 NGF 含量与放射性计数的线性关系，并由静脉注射至家兔体内，通过上述检测方法得到不同时段血浆中微量 NGF浓度，使用 3P87 软件分析药代动力学参数并初步分析组织分布。结果 NGF 静脉注射后的家兔体内代谢符合二隔室分布模型；按剂量 40g/kg 静注后，测得T1/2=0.077h、T1/2=0.88h、AUC=98.6514nghml。
2、结论 99mTc 具有较好的示踪效果，适用于体内药代动力学研究。【关键词】 99mTc-NGF；药代动力学；TCA 沉淀法【Abstract】 Objective To study the pharmacokinetics of NGF in rabbit by isotopic tracing. Methods NGF was labeled with99mTc，and its -ray counts was detected by isotopic tracing and trichloroacetic acid ( TCA) precipitation method. From cpm
3、of -ray and NGF content of samples， the 2standard curve was drawn and it was nearly a line.99mTc-NGF was injected into rabbit(n=30) body from vena auris . Samples of rabbit blood were collected in different time (0.00833， 0.0166， 0.05， 0.0833， 0.166， 0.25， 0.5， 1， 1.5， 2， 2.5， 3， 3.5， 4h). The techn
4、iques above were used to detect NGF concentration in rabbit blood and data were inputted into computer to analysis the pharmacokinetic parameter by software (3P87). Results The metabolism in vivo conforms the double-compartments model. With the dose of 40g/kg， the pharmacokinetics parameters were as
5、 the follows： T1/2=0.077h、T1/2=0.88h、AUC=98.6514nghml。 Conclusion The mark of 99mTC has better effect on pharmacokinetic research of nerve growth factor.【Key words】 99mTc-NGF； pharmacokinetics； TCA 神经生长因子（NGF）是神经营养因子家族中最重要的生物活性物质，其对神经元的生长、发育、分化、再生和功能表达具有重要的调控作用。现阶段其在应用上已经公认对脑和脊髓损伤、早老性痴呆13 、糖尿病周围神经性疾
6、病 4等有很好效果。发现者 Stanley Cohen 和 Rita Levi-Montalcini 于 1986 年获得诺贝尔3医学奖5 。有关 NGF 的血药浓度检测已有很多报道，但都比较复杂。本文将 NGF 用 99mTc 标记，利用同位素示踪法和 TCA 沉淀法测得 NGF 含量，从而初步研究 NGF 脂质体在家兔体内药代动力学，以期为其他相关试验及今后的临床应用提供必要的参考资料。1 材料与方法1.1 仪器与试剂1.1.1 仪器 GC-911 射线计数仪（中国科技大学仪器厂） ； Ultrospec2000 紫外分光光度仪 (Pharmacia 公司)； DFM-96 多排放射免疫计
7、数仪（众成电机技术公司） ； FJ-391A1 型活度仪（北京放射性仪表厂） ； 3P97 软件(江苏省人民医院药剂科合作提供)； FA1004 电子天平（上海精科天平） 。1.1.2 试剂 小鼠颌下腺 2.5S NGF（南京军事医学研究所提纯，纯度98%，文章另发） ；99mTcO4(北京原子高科核技术应用股份有限公司)； 亚锡（上海化学试剂三厂） ； Kieselgel 60 F254 硅胶板（德国 EM science） ； 柠檬酸缓冲液（南京森科医药公司） ； 三氯乙酸（南京生兴生物技术公司分装） ； Sephadex G-25(南京森科医药公司提供 )。41.3 实验动物 实验用新西
8、兰兔( 雌雄各半、2.5kg，南京爱立默动物实验有限公司)。1.4 方法1.4.1 同位素示踪法与 TCA 沉淀法检测血浆中微量 NGF 用放射性元素 99mTc 标记 NGF，对 99mTc-NGF 用 TCA 沉淀6 ，然后对沉淀物进行 计数仪计数，数值与 NGF 的含量存在线性关系，从而测定在血浆中微量 NGF 的浓度。1.4.1.1 标准曲线的制备 99mTcNGF 的制备：配制 0.5亚锡（Sn2）柠檬酸缓冲液（ cit） 。取 NGF20ml（含 20mg NGF） 、cit 溶液 100ml 及配制的 0.5Sn2-cit 溶液 20ml，将其置于小瓶中，充入氮气 35min ，
9、即制备完药箱置于 4 冰箱待标记时取出。加 10mgVitC 于 cit 溶液中，制备成 10mg/mlVitC 溶液；取出制备的药箱，在其小瓶中加 0.3ml 高锝酸（ 99mTcO4）(具体放射量根据需要)，然后加入配制的 10mg/mlVitC 溶液 0.1ml，混匀。即制备完 99mTcNGF。样品经 Sephadex G-25 凝胶柱分离纯化，收集各组分，测量每管的 计数，合并各峰收集组分并取出 60l，加考马斯亮蓝 R-2505染色，用紫外分光光度仪测定 595nm 处的吸光度，计算 NGF 的化学量。以收集 99mTc-NGF 峰的总放射性除以上样层析时的总放射性，即得 99mT
10、c-NGF 的标记率。99mTc-NGF 峰的总放射性除以该峰的总蛋白质量，即得比活度。纸层析法测定 99mTc-NGF 的放化纯度。配制 10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、500ng/ml 及1000ng/ml99mTc-NGF 溶液各 1 份，各吸取 20ml 于试管中，加150l 生理盐水及 30l 兔血清，加 20三氯乙酸200l，5000rpm 离心 3min。去上清，测定各试管中沉淀物放射性计数，绘制标准曲线，求回归方程及回归系数。1.4.1.2 测定方法的确证 通过检测回收率及重复性试验研究证明该方法的可行性。(1)回收率的测定：配置 99mTc-NGF 浓度为2
11、50、 500、 750ng/ml 各 5 份，然后按照上述方法（标本处置同标准）测定实测 99mTc-NGF 的浓度；共进行 5 次计算该方法及线性关系回收率。每次测定前同时测定标准品沉淀物的放射性计数并绘制标准曲线以去除核素衰变影响。(2)精确度的测定：配制成浓度为250、 500、 750ng/ml 的 99Tc-NGF 样品各 5 份，按照上述方法（标本处置同标准）测定 NGF 浓度，每个浓度一天内重复测定 5次，计算日内相对标准偏差；每天测定 1 次，连续 5 天测定，计算日间相对标准偏差，测定当日重新标记和配制标准液。61.4.2 实验方法 操作当日标记 99mTcNGF ，按上述
12、方法测定放化纯度和比活度。取 5 只等重健康家兔（ 2.5kg，雌雄各半） ，静脉注射 NGF，剂量均为 40mg/kg。快速于一侧耳缘静脉注射后，压迫止血，立即于另外一侧耳缘静脉用采血针头从近心端向远心端分别于30s、1min、3min、5min、10min 、15min、30min、1h 、1.5h、2h、2.5h 、3h、3.5h 及 4h 采血，采血时使用 20ml 定量毛细虹吸管吸取血样，快速将血液加入内有 1ml 生理盐水的试管中，然后再加入 20三氯乙酸 0.5ml，5000rpm 离心 3min。去上清，沉淀物封口保存后待统一测定。1.4.2.1 血药浓度的测定 待所有血样和标
13、本采集完成后，配制10ng/ml、 50ng/ml、 100ng/ml、500ng/ml 及1000ng/ml99mTc-NGF 溶液各 1 份，各吸取 20ml 于试管中，按（方法参照 99mTc-NGF 的制备）处理标准品后，沉淀物与处置后的待测样本同时置于多样本放射免疫计数仪中，测定各试管中放射性计数，绘制标准曲线，并测定各血样的放射性计数。将计数带入标准曲线即相应的血药浓度。1.4.2.2 静脉推注 NGF 在家兔体内药代动力学参数的分析 将所7测定的 NGF 在家兔体内不同时间的血药浓度输入计算机，用 3P87 软件分析药代动力学参数及房室模型。2 结果2.1 标记率为 98.7%，
14、比活度为 30mCi/mg，放化纯度99%。2.2 配制 10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、500ng/ml 及1000ng/ml99mTc-NGF 溶液各 1 份，各吸取 20ml 于试管中，加150l 生理盐水及 30l 兔血清，加 20三氯乙酸200l，5000rpm 离心 3min。去上清，测定各试管中沉淀物放射性计数，绘制标准曲线，求回归方程及回归系数。2.3 经测定，标准曲线为 y=454.41x+9169.6 (x 值为 NGF 浓度)，R20.9949。将所测定血样放射性计数经曲线方程处理后得到相应血药浓度，血药浓度经 3P87 软件分析后根据 F 检验和 AI
15、C 值选择相应房室模型为二室模型为宜并得到药代动力学参数。结果见表 1。表 1 静脉注射 99mTcNGF 兔体内药代动力学参数8注： n5结果显示：当给药剂量为 40g/kg 时，NGF 药动学参数为T1/2=0.077h、T1/2=0.88h、AUC=98.6514nghml。3 讨论检测血液中 NGF 浓度常用方法有 ELISA、HPLC 等，这些方法灵敏度和精确度均较高，相关文献很多，但是操作繁琐，费用较高，影响结果因素较多。本实验在选择同位素示踪法来检测 NGF 血药浓度，此方法通过放射性原理避免了对 NGF 的检测方面的影响。同位素示踪常用核素有 125I、99mTc 等，125I
16、 半衰期长较为稳定，但标记率很低，且对环境和同位素防护及处理要求非常高，因此在使用时收到很多限制；99mTc 标记率高 7 ，同位素处理简单，对人员身体影响小，但半衰期短，对检测时间要求相对较高。本实验中笔者通过 99mTc 标记 NGF，使用 TCA 沉淀法及同位素示踪法进行血液中微量 NGF 浓度检测，通过药代动力学相关参数分析，证明静脉注射 NGF 在小鼠体内的药代动力学符合双隔室模型，是一种很好的药物代谢研究方法。9【参考文献】1 Boado RJ， Tsukamoto H， Pardridge WM.Drugs delivery of antisense molecules to the brain for treatment of Alzheimers disease and cerebral AIDS.Journal of Pharmaceutic
