《几种植物中的过氧化物酶同工酶分析1)》由会员分享，可在线阅读，更多相关《几种植物中的过氧化物酶同工酶分析1)（5页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、遗传H E R E D I T A S ( B e i j i n g ) 2 ( 3 ) ; 7 -1 0 1 9 8 0几 种 植物中的 过氧 化 物酶同 工 酶 分析 黄 寿松 2 ）翁坚（ 中国科学院上海生物化学研究所）研究报月匕 口过氧化物酶 ( E . C . 1 . 1 1 . 1 . 7 )是一族 能够利用H , 0 2 氧化供氢体的酶。它对H , O ： 的 需求是非常专一的，而对供氢体的要求则较为 广泛。 酚类、 胺类化合物、某些杂环化合物和 一些无机离子等都可以作为过氧化物酶的供氢 体。它们的催化反应式为： A 巩 H 20 , 二 A 2 H ,O 式中A I I ,
2、为供氢休，A为氧化型产物，E为过氧化物酶。 过氧化物酶是由一个糖蛋白和一个氯正铁 血红素 I X ( P r o t o h e m i n I X ）的铁吓琳辅基缀合而成。 在高等植物中，过氧化物酶广泛而大量地 存在着， 并且有较多的同工酶， 如无花果树汁和 辣根等。研究表明， 在植物不同的生长发育时 期和不同的组织器官中，过氧化物酶同工酶的 数目和活性有很大的变化 2 - 4 1 。 并且植物激素 也会影响它的酶谱，如 7 1 嗓乙酸会抑制小麦和 豌豆植株过氧化物酶某些同工酶的表达， ， 而 乙烯能引起if c 豆和甘薯中过氧化物酶某些同工 酶的增加7 1 。此外， 据报道， 棉花等植物的
3、抗病 性与过氧化物酶有关t 1 0 过氧化物酶同工酶可采用电泳、层析等多 种分离方法，最常用而分离效果较好的是聚丙 烯ft胺凝胶电泳法。 过氧化物酶同工酶的染 色方法也有多种。经典的有饱和联苯胺染色 法12 1 o L iu进一步提出测定植物组织抽提液各 个过氧化物酶同工酶相对活性的维生素C 一联 苯胺染色法阁。近些年来又较多地采用了丁子 香酚 ( E u g e n o l )一类夭然物作底物的新染 色法9 1 c 近年来， 由于同工酶测定、 分析技术在遗传育种、 物种分类、 预测杂种优势、 植物保护和植 物生理等诸方面的研究工作中被广泛采用。为 此， 我们对植物的过氧化物酶同工酶的分离、
4、分 析技术作了一些研究，以期伐出适合于我国需 要的简便可行、迅速可靠的过氧化物酶同工酶 狈 i 定分析法。材 料 和 方 法（ 一）材料和样品的制备 水稻、 高粱、 小麦和长穗傻麦草等植物的种 子用1 0 的安替福民（ A n ti f o r m i n ） 消毒、洗涤 后， 置2 5 恒温箱中温育发芽 4 -5 天， 取幼苗 3 -5 个置预冷小型玻璃匀浆器或研钵中， 加人 0 . 1 毫升水研磨匀浆，将样品移至小离心管中， 离心（ 3 5 0 0 ： p . m . ) 1 5 分钟， 取上清液， 混人等 体积 5 0 务的蔗糖溶液。电泳时， 每根凝胶管加 0 . 0 5 毫升的样品制备
5、液。 （ 二）试剂和主要设备试剂：丙烯酸胺 ( a c ry la m id e ) 、甲叉双丙烯酞 胺( m e t h y le n e b i s a c r y l a m i d e ) 、 四甲基乙二 胺 ( N , N, N , N - te t r a m e t h y l e t h y l e n e d i a m id e ，简称 T E _M E D ) 、 三经甲氨基 甲烷 ( T r i s ) 、甘氨酸、 过硫酸按、 蔗糖、 嗅酚蓝( B r o m o p h e n o l b l u e ) 、 联苯胺( b e n - z i d in e ) , 邻
6、联（ 二） 茵香胺（ o - d ia n i s i d i n e ) 、 冰醋酸、 无水醋酸钠、 维生素C 、 过氧化 氢，全部为分析纯（ A . R 级） 或化学纯 ( C . P .级) o主要设备：Hu a n g S h o u s o n g e t a t . : A n a l y s i s o f P e r o x i d a s e s o e . n z y me s i n S e v e r a l P l a n t s 1 )本工 作曾得到龚葵同志的指导， 特致谢意 ， 2 ) 黄寿松：西北植物研究所进修人员。了1 电源直 流 稳 压 电 源，电 压 为
7、0 - 1 0 0 。 伏特， 电流为。 -1 0 0 毫安。木所制造。 2 电泳槽上海新光化工厂产品提篮式电泳槽。 3 装凝胶用的玻璃管内径为 5毫米，长度为 9 0毫米。 4 . 普通离心机 （ 4 0 0 0 r . p . m . ) o （ 三、同工酶的分离、 染色和鉴定 我们采用聚丙烯酸胺凝胶盘状电泳技术分 离植物过氧化物酶同工酶，并用两种不同浓度 的凝胶系统进行了对比试验；此外还进行了样 品朝电极正、负极各自单向电泳和双向电泳的 试验。不同浓度凝胶的配制方法见表 t o电泳在冰箱或低于 1 5 的 室 温 下 进 行。 每根凝胶7 厘米长， 使用电流 2 m A 。用0 .0 0
8、 5 界澳酚蓝二滴加人电泳槽上槽内，当澳酚蓝迁移 至凝胶下端 0 .5 -1厘米处停止电泳。电泳时间约 9 0 - 1 0 0 分钟。 过氧化物R 同工醉 的染色鉴定方 法 很 多，表 1 不同浓度凝咬系统的配制表 2 数种过氧化物酶同工酶染色法现列数种于表 2 。丁 叮 会凝胶系统1 0 凝 胶 票 统贮A. 1 N HCI 4 8 . 0 m1 ; A丙烯酞胺 2 4 . 3 5 6 , 加 F液至 存Tr i s 3 6 . 4 6 ; ; 1 0 0 m1 , i 夜r F % I F I )0 2 3 1 1 1 卜F 甲叉双丙烯酞 按 日 . 7 5 fi加 力 只 ; ; = 1
9、 0 a 1 1 1 , F 液至1 0 0 1 11 1 p H 8 . ? C . F e S O , “ 7 H（ 、l o i n g溶于 C .丙烤酞映 2 。 织1 0 0 ml 水 ， 甲叉双丙烯醚按1 ) . T F MF D 原液。0 . 7 3 5 6; ; F 过硫酸被（ 用前配制） 力 i 水至 1 0 0 n 1 1 . 斗 F 过硫酸按（ 用前配划、F . Tr i s - 泞檬酸缓冲液忿1. 4 呢 , Ir i s 1 5. 5 8 柠 檬 酸 1 . 0 g ; 加水至 1 0 0 0 m 1 , P H R . 9 配 狡A: C: l 沈H ） 一 : B
10、 : C: 1 ) : F: F 1 0 : 1 0 : 1 : 2 : 0 . - 1 : 4 . 6 0. 2 5: 1小 洁: 0. 2 5: 4 不 r r i s 3 0 . 0 q ; Tr i s 6 . 2 g ; 甘氨l ,n : 1 斗 斗 9 ；甘氨酸 2 . 0 k ; 加水至 1 0 0 0 r n l ,爪 1 . 3 : 加水至 1 0 0 0 ml , p H h . 7 ; 使用时杯释 1 0 信随用时稀释 5倍染色方法染色液池和联苯胺法饱和联苯胺水溶液 1 0 0 ml , 3 H, O , i n , 将凝胶浸入染色液 中， 3 7 0 C保温 染色 3
11、一6 0 分钟维生素 C 一联苯胺法醋酸联苯胺溶液， ) 2 0 m卜 维生素C 7 0 . 4 mg ;将胶7 X人染色液中染色 2 -3 分钟 后取 3 %H, O , 4 ml ; H, O 7 6 m 1 出， 在水中 叫先 数次， 停止染色维生素 C 一半量联苯胺法酷酸联苯胺溶液 l O m卜素维生 c 7 0 . 4 m g ; 将胶浸人染色液中染色 1 ( 一1 5 分 钟后 3 0/ r , H, O, 4 m 1 ; H, O 7 6 m1 取出， 置水中漂洗数次， 终止染色。M e 酸联苯胺法醋酸联苯胺溶液 5 m1 ; 3 %H夕： 2 m1 ; H, O 将胶浸入染色液
12、中5 一1 0 分神，取出置 ? 3 m1 于永 中 沈 ， 停止染 色。将胶置于醋酸缓冲液中沁 2 。 分钟， 再浸 入染色液中，2 0 保佩染色 2 5 - 6 0分钟 后， 取出， 水漂洗。1 ) 酷酸联苯 胺炸液：2 克联茉胺溶于 1 8 毫升醋酸中， 加7 2 毫升水。结 果 和 讨 论（ 一）不同浓度聚丙烯酞胺凝胶 系统的分离结果 在水稻、高梁等植物 幼苗过氧化物酶同工酶 的分离试验中，分别用两种不 同浓度的聚丙烯酸胺凝胶系统。结果 7 弧 的凝胶系统分离效 果较好（ 图版I , 1 ) 。 分离出的同工酶谱带较多， M 4 谱 也较清晰。从（ 二）凝胶预电泳对分离结果的影响 催化
13、剂过硫酸按是一种强氧化剂。如果与 样品中某些酶蛋白起反应， 会引起酶谱失真。 因 此， 在使用过硫酸按作催化剂时， 常将凝胶预电 泳以去除凝胶 中的过硫酸按，然后再加样品进 行电泳分离。在植物过氧化物酶同工酶的分离 中， 样品朝正极泳动时 ， 由于过硫酸钱分子小， 它比酶蛋白和澳酚蓝娜泳动得快 图版 1 , 2 ) , 所以不影响过氧化物酶同工酶的分离。从图版1 , 3 还可以看到，预 电泳去除过 硫 酸 按 的 凝 胶所分离的过氧化物酶 同工酶的正极泳动酶谱 效果，反而不及未预电泳的凝胶分离的酶谱清 晰。 为此， 用过硫酸钱作催化剂的凝胶分离分 析正极向泳动的过氧化物酶同工酶时，不需要 预电
14、泳。（ 三）负极向同工酶谱的分析 植物过氧化物酶 同工酶的 等 电 点 可 以 在p H3 -1 1 的范围里，因此在用p H 8 .9 的聚丙烯 酚胺凝胶电泳分离同工酶时，常有朝负极泳动 的酶带。 在许多植物的过氧化物酶同工酶谱中，其正极向的同工酶谱相同，而负极向的同工酶 谱却有差异，如小麦的小僵四号和小堰五号两 品种，小擅五号的负极向酶谱就比小 堰四号的 多一条同工酶带（ 图版 1 , 4 ) 。所以， 在研究植 物过氧化物酶同工酶时，还要注意分析负极向 的同工酶谱。我们对朝负极泳动的过氧化物酶同工酶的 分离法进行了一些研究，结果表明朝正极和朝 负极泳动的同工酶用两管凝胶分别电泳分离， 要
15、比样品置于同一管凝胶的中间， 正、 负极向同 工酶同时电泳分离的效果好（ 图版1 , 4 ) 。 因正、 负 极向的同工酶同时电泳分离时，在一段凝胶加 样后还需在同一管的样品上面注加另一段凝 胶。若样品较多， 在凝胶聚合后的样品附近往 往会出现一层较稀软的凝胶，致使电泳分离酶 谱不易稳定。此外， 凝胶中的过硫酸按在电泳 分离时，正好与朝负极泳动酶带的泳动方向相 反， 从而易产生干扰。 我们所用的过氧化物酶负极向同工酶的分离方法基本上与正极向的 同工酶 分 离 方 法 类 同。所不同的是：( 1 ) 所用凝胶需预电泳去除 过硫酸钱； ( 2 ) 在加人样品后， 其上面还需再加 上一层 1 厘米厚
16、的凝胶，以防止样品跑到正极 电泳缓冲液中去； ( 3 ) 另外用一支凝胶管， 样品 中加人澳酚蓝， 倒转插入电泳槽内， 仍让澳酚蓝 朝正极泳动， 以作电泳终止的标记。（ 四）数种染色方法的结果比较1) 在植物过氧化物酶同工酶的鉴定分析中， 我们对数种染色法进行了一些对比试验。结果表明， 邻联 （ 二） 茵香胺法的染色效果较差， 许 多酶带显色不明显或不显色（ 图版1 , 5 ） 。饱和 联苯胺法染色的酶带较清晰，但往往有些活力 较弱的酶带不够清晰 （ 图版1 , 6 ) ， 染色时间也 较长。 维生素 C 一联苯胺法染色的 时 间 很 短 （ 二、 三分钟） ， 个别酶带即使刚显色就将凝胶从 染色液中取出， 用水漂洗终止染色， 也往往会造 成酶谱染色过深，所以此法染色时间较不易掌 握， 而且呈现的酶带有“ 内聚” 现象（ 反凝胶断面 的中间着色） ， 需用的试剂量也太大。 我们曾试把 醋
