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1、分类号：R 3 9 2 1密级：不保密学位类别：科学学位团专业学位口0学校代码：1006 2学号：2 0 1 0 6 0 2 0 1 9学科门类：理学 又坪鼍科鼻等硕士学位论文M A S T E R SD I S S ER I I A T I o N论文题目：G 3 B P l 在乳腺癌与肺癌细胞体外迁移中作用的研究TIT L ER e s e ar c h e so fG 3 B P li nt h e nv i t r oM i g r a t i o no fB r e a s tC a n c e ra n dL u n gC a n c e rC e l l s一级学科：生物学二级学
2、科：生物化学与分子生物学论文作者：韩垄指导教师：张宁教授导师组成员：张宁，耿华天津医科大学研究生院二。一三年五月学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外，论文中不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以
3、供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文，并编入有关数据库。保密I - 1 ，在年解密后适用本授权书。本论文属于r 啊 不保密lVl 。( 请在相对应的方框内打“”) 学位敝储虢握堕R 期脚如黼导师签名：幺雪!同期：z 口，孑年，月升同天津医科大学硕士学位论文中文摘要目的：研究G T P 酶激活蛋白S r c 同源结构域3 结合蛋白l G T P a s ea c t i v a t i n gp r o t e i n ( S r ch o m o l o g yd o m a i n3 ) - b i n d i n gp r o t e i n1 ，G 3 B P l 】是否参
4、与了人乳腺癌细胞系M D A M B 2 3 1 及人非小细胞肺癌细胞系A 5 4 9 的体外迁移过程，并在结果为阳性的前提下尝试提出可能的理论机制。方法：一：免疫印迹法检测M D A M B 2 3 1 中G 3 B P l 表达水平是否与文献报道一致；向M D A M B 2 3 l 细胞内转染以G 3 B P l 的m R N A 为靶点的小干扰R N A( s m a l li n t e r f e r i n gR N A ，s i R N A ) 以抑制G 3 B P l 的表达；趋化实验检测抑制G 3 B P l 表达后M D A M B 2 3 1 细胞穿过1 0 p , m
5、 聚碳酸酯膜的数量；1 0 n g m l 表皮生长因子( e p i d e r m a lg r o w t hf a c t o r , E G F ) 分别刺激3 0 s 、l m i n 、2 m i n 以及5 m i n时M D A M B 2 3 1 细胞内G 3 B P l ，P K C ( ，A k t ，p P K C “ r h 7 4 1 明0 3 和p A k t s 。4 7 3 的表达情况。免疫共沉淀法检测M D A M B 2 3 1 内G 3 B P l 是否与P K C 0 0 5 ) ，而乱序对照组、空白对照组分别于实验组穿过膜的细胞数具有统计学差异(
6、P O 0 5 ) ，而乱序对好组、空白对照组分别与实验组穿过膜的细胞数具有统计学意义( 尸 O 0 5 ) 。表明G 3 B P l 表达抑制后A 5 4 9 细胞趋化能力受到明显抑制。空白对照组乱序对照组实验组图8 ：G 3 B P l 表达抑制后A 5 4 9 趋化能力显著降低。空白对照组：不转染任何小R N A序列的A 5 4 9 细胞；乱序对照组：转染s c r a m b l eR N A 的A 5 4 9 细胞；实验组：转染s i R N A的A 5 4 9 细胞。2 2 3 抑制G 3 B P l 表达后A 5 4 9 细胞运动能力显著下降如图9 所示，1 2 h 后乱序对照组
7、与实验组细胞整体迁移平均距离分别为O 1 3 m m 和0 0 2 m m ，两者之间的差异具有统计学意义( 尸 O 0 5 ) 。表明G 3 B P l表达抑制使A 5 4 9 细胞的运动能力受到明显抑制。1 4一州叫叭毗啪托瑟：；荸：姑如bM弓o牛v鼎翟累餐龃涮j璺蹦捌酞天津医科大学硕士学位论文二、G 3 B P l 参与t H , 细胞肺癌的体外迁移O h1 2 hA 5 4 9t r a n s f e c t e dw i t hs i R N A一乱庠对照组 1 6 实验组1 4名1 2至三l o更 、一8 椒 器s 划 翟4 再，。7A 5 4 9t r a n s f e c
8、t e dw i t hs c r a m b l eR N Az丰l ：时闷( h )图9 ：G 3 B P l 表达抑制后A 5 4 9 运动能力显著降低。2 2 4 抑制G 3 B P l 表达后A 5 4 9 细胞体外侵袭能力显著下降如图1 0 所示，转染了s c r a m b l eR N A 的A 5 4 9 细胞为乱序对照组，对数生长期A 5 4 9 细胞为实验组。两组穿过人工基底膜的细胞均数分别为3 4 和6 ，两者之问的差异具有统计学意义( P 0 0 5 ) 。表明G 3 B P l 表达抑制使A 5 4 9 细胞的体外侵袭能力受到明显抑制。1 5天津医科大学硕士学位论文
9、二、G 3 B P l 参与非小细胞肺癌的体外迁移。厂套： 囔带4 气蠓气i 瓤- -。? 文渗知- ，毒。 曩静熏 一。：铲实验组乱序对照组图1 0 ：G 3 B P l 表达抑制后A 5 4 9 细胞的侵袭能力显著降低。2 2 5G 3 B P l 在其他肺癌细胞系中表达水平不一致经免疫印迹法检测，如图1 1 所示，G 3 B P l 在H 1 2 9 9 和G L C 8 2 中的表达水平与其在A 5 4 9 和M D A - M B - 2 3 1 中的基本一致，故仍可认为上述两种肺癌细胞的内源性G 3 B P l 过表达。但G 3 B P l 在N C I - H 3 5 8 中表达
10、水平要远远低于其在另外4 中细胞中的表达水平，因此可认为N C I - H 3 5 8 细胞中的内源性G 3 B P l 低表达。G 3 B P l 在不同的肺癌细胞系中表达水平不一致，这与文献报道结果吻合1 3 , 5 】。G 3 B P lB a c t i nN C I M D A A 5 4 9H 1 2 9 9H 3 5 8G L C 8 2M B - 2 3 1图l l ：G 3 B P l 在3 种肺癌细胞系H 1 2 9 9 ，I t l 2 9 9 和H N C l 3 5 8 中的表达情况。内源性G 3 B P l 在前两种肺癌细胞中过表达，在第三种肺癌细胞中地表达。A 5
11、 4 9 及M D A - M B - 2 3 1为阳性对照。1 6如拈笃如H；。o十v氟翟再百善暑星捌蚀天津医科大学硕士学位论文二、G 3 B P l 参与非小细胞肺癌的体外迁移2 3 讨论2 3 1G 3 B P l 在A 5 4 9 细胞中过表达，但在肺癌细胞中表达水平不一致经免疫印迹法检测，G 3 B P l 在A 5 4 9 细胞中过表达。这表明G 3 B P l 很有可能参与了A 5 4 9 细胞的某些重要功能。2 3 2G 3 B P l 在A 5 4 9 趋化过程中发挥重要作用将小干扰R N A 转染A 5 4 9 细胞之后，肺癌细胞的体外趋化能力显著下降，据此推断G 3 B
12、P l 是在A 5 4 9 转移过程中的起重要作用的蛋白质之一。A 5 4 9 内源性G 3 B P l 过表达很有可能与增加癌细胞趋化能力有关。2 3 3G 3 B P l 在A 5 4 9 定向运动过程中发挥重要作用将小于扰R N A 转染A 5 4 9 细胞之后，肺癌细胞的定向运动能力显著下降，据此推断G 3 B P l 是在A 5 4 9 定向运动过程中的起重要作用的蛋白质之一。A 5 4 9内源性G 3 B P l 过表达很有可能与增加癌细胞定向运动能力有关。2 3 4G 3 B P l 在A 5 4 9 侵袭过程中发挥重要作用将小干扰R N A 转染A 5 4 9 细胞之后，肺癌细
13、胞的体外侵袭能力显著下降，据此推断G 3 B P l 是在A 5 4 9 侵袭过程中的起重要作用的蛋白质之一。A 5 4 9 内源性G 3 B P l 过表达很有可能与增加癌细胞侵袭能力有关。2 3 5G 3 B P l 在肺癌细胞中表达水平不一致G 3 B P l 并非在所有肺癌细胞中均过表达。具体到本实验，G 3 B P l 在H 1 2 9 9和G L C 8 2 中过表达，但在N C I H 3 5 8 中则表达水平很低。根据G 3 B P l 在肺癌细胞中的这种表达水平的不一致性，推测该蛋白质在不同种类的癌细胞中可发挥多种调控作用，而且该蛋白质所参与的信号通路可能不止一条。天津医科大
14、学硕士学位论文结论结论当口- ，匕1 、G 3 B P l 参与乳腺癌转移的可能机制G 3 B P l 通过与R a sG T P 酶活化蛋白( R a sG T P a s e a c t i v a t i n gp r o t e i n ，R a s G A P ：I Q G A P l ，P L X N B l ，R A S A L l 和R A S A L 2 这四种蛋白质的总称) 上的S r e 同源结构域3 ( S r cH o m o l o g yD o m a i n3 ，S H 3D o m a i n ) 相结合可以抑制R a s G A P s 的活性。因R a s
15、 G A P s 可以水解G T P 而使R a s 处于结合G D P 的失活状态，故G 3 B P l与R a s G A P S 的结合可以解除后者对R a s 活性的抑制，使R a s 保持在与G T P 结合的激活状态，而活化的R a s 可以通过多种不同的机制参与促进肿瘤转移的过程。之前有研究显示G 3 B P l 与R h o C 在食道癌细胞中有相互作用【1 0 1 ，为这一推测提供了一定佐证，因为R h o C 是参与调控肿瘤细胞运动性的关键蛋白质之一【15 1 。活化的R a s 可以通过一系列机制参与促进癌细胞( 例如肺癌、胰腺癌与结肠癌) 的转移【l 酬。这些机制包括：
16、( 1 ) 通过参与建立肿瘤细胞前端后端的非对称性，直接地使癌细胞获得运动性。具体途径包括：参与肌动蛋白的聚合、组织与收缩；参与微管蛋白的聚合；调控参与有丝分裂的基因的转录。( 2 ) 通过削弱细胞一细胞间以及细胞一细胞外基质问的相互作用，间接地使肿瘤细胞获得运动性。具体途径包括：通过上调E 钙粘蛋白( E c a d h e r i n ) 转录抑制因子S N A I L ( 也称作S N A I L l ) 与S L U G ( 也称作S N A I L 2 ) 而降低E 钙粘蛋白的表达水平；刺激E 钙粘蛋白水解；介导E 钙粘蛋白启动子甲基化；降低E 钙粘蛋白一D - 连环蛋白( 1 3 - c a t e n i n ) 复合体的稳定性并使1 3 - c a t e n i n 重新定位；降低整合蛋白亚基的表达水平。( 3 ) 使肿瘤细胞获得侵袭性。具体途径包括：降解细胞外基质；抑制蛋白酶抑制因
