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1、质粒构建实验步骤质粒构建实验步骤实验一实验一1 将合成的引物溶解（10uM） ，分别扩增 P1P2，P3P4，2 PCR 扩增条件如下：95 10 min95 30 s50 30 s 10cycle72 30 s 72 5min3.反应体系为：20 ul （p1p2 和 p3p4 各两管）dNTP 2 ul10xBuffer 2ulTaq 0.4 ulPrimer P1 （P3） 1.0 ulPrimer P2 （P4） 1.0 ulH2O 13.6 ul4将产物电泳，检测是否为目标片断（分别为 A1B、A2B）,证实为目的片断以后，进行后续扩增5 将扩增出的AB和 CD 片断等摩尔加入作为模
2、板进行第二次 PCR，并且在第二次PCR 时加入引物扩增 25 个循环，PCR 扩增条件如下：95 15 min95 30 s60 30 s 25cycle72 40 s 72 5min6反应体系为：100uldNTP 10 ul10xBuffer 10 ulTaq 1ulProduct P1P2 2 ulProduct P3P4 2 ulPrimer F 1 ulPrimer R 1 ulH2O 73ul实验二实验二 连接连接 载体 DNA 外源 DNA 片段 10T4 DNA ligase buffer T4 DNA ligase 0.5l 16保温 8-24 小时。 做二组对照反应，其中
3、对照组一只有质粒载体无外源 DNA；对照组二只有外源 DNA 片段没 有质粒载体。 实验三实验三10 转化取 100 ul 感受态细胞置于冰上融化，将 50ul 感受态细胞加入至 10 ul 连接产物中，冰上30min。42放置 4560s，冰上放置 23min。加入 37预温好的 200ul LB 液体培养基（不含 Amp）37振荡培养 1h（160220 rpm）11 铺板 铺板之前要先将 AMP 抗性的 LB 固体培养基先预温到常温，然后取 100 ul 菌液涂板，37培养过夜（1624h）12不带有质粒 DNA 的细胞,由于无 Amp 抗性,不能在含有 Amp 的筛选培养基上成活。 挑
4、选菌落接种于 5 mL 含 Amp 的 LB 液体培养基中，37振荡培养过夜。13. 取 1 ul 菌液进行菌落 PCR。（回收产物和水做对照）PCR 扩增条件如下：95 15 min95 30 s（60） 30 s 30cycle72 40 s 72 5min反应体系为：20uldNTP 2 ul10xBuffer 2 ulTaq 0.2 ul菌液 1 ulPrimer F 0.4 ulPrimer R 0.4 ulH2O 14 ul14.2%琼脂糖凝胶电泳检测15.取阳性克隆菌液送测序鉴定，结果正确后，提取质粒 质量要求：质量要求：1.测序图：与拼接的序列完全吻合（每个位点有两个质粒，有两张测序图）2. 质粒电泳图：（用 P1 和 P4 的上游引物和下游引物扩增）在电泳图上有两条较亮的条带：一条为目的片断，另一条为两千多 bp 的超螺旋条带。3. OD260/OD280 的比值在 1.82.0 之间。4. 提取质粒的浓度不低于 100ug/ml。
