蛋白质含量的测定

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1、3-1蛋白质含量的测定蛋白质含量的测定一、实验目的一、实验目的 1.学习考马斯亮蓝测定蛋白的原理 2.了解分光光度计的使用 3.注意小组的分工合作二、原理二、原理 考马斯亮蓝 G-250 在游离态下呈红色，当它与蛋白质的疏水区结合后变为 青色，后者最大光吸收在 595nm。蛋白浓度在 0-100g/ml 范围以内，蛋白质-色 素结合物在 595nm 下吸光度与蛋白质含量呈正比。蛋白质与考马斯亮蓝 G-250 结合在 2min 左右的时间内达到平衡，其结合物在室温下 1h 内保持稳定。三、仪器、器皿及试剂三、仪器、器皿及试剂 天平、试管、吸管、研钵、50ml 容量瓶、离心管 标准牛血清蛋白液（1

2、00g/ml） 、G-250 溶液。四、实验步骤四、实验步骤 1.标准曲线绘制标准曲线绘制 取 6 支试管编号，按下表数据配制 项目项目123456 标准标准 Pr（ml）0.00.20.40.60.81.0蒸馏水蒸馏水 （ml）1.00.80.60.40.20.0G-250（ml）5.05.05.05.05.05.0 Pr 含量含量 （g）020406080100配制完毕，摇匀后，放置 2min，在 595nm 下测定吸光值。 2.样品蛋白质含量测定样品蛋白质含量测定 准确称量 1g 菠菜和青菜，加入 5ml 蒸馏水研磨，研磨成匀浆，离心 （4000r/min，10mins）后，上清液转入

3、50ml 容量瓶，并用蒸馏水定容。 取 0.1ml 样品提取液，按下表配制 菠菜菠菜青菜青菜项目项目123456 样品样品 （ml）0.10.10.10.10.10.1H2O（ml）0.90.90.90.90.90.9 G- 250（ml）5.05.05.05.05.05.0配制完毕，摇匀后，放置 2min，在 595nm 下测定吸光值。五、作业五、作业 1.标准曲线的绘制标准曲线的绘制3-2123456 OD5950.0000.7871.2021.3941.4651.490 因为曲线的前部分是呈线性的，后面逐渐与 x 轴平行，再加上所测数据主 要集中在吸光值 0.050-0.150 之间，在

4、图像的前段，所以经过讨论后，我组将第 5、6 个数据去除，而保留了第 1、2、3、4 个数据，最后得出了如下图的标准 曲线。2.计算样品中蛋白质含量计算样品中蛋白质含量根据标准曲线计算样品中蛋白质的含量。 菠菜菠菜青菜青菜项目项目123456 OD5950.1050.0910.0810.1380.1140.147 Pr 含量含量 （ug）3.9923.4603.0805.2474.3355.589平均（平均（ug）3.5115.507 据上述操作所知，所测样品的稀释倍数为 500 倍，即可知： 菠菜的蛋白质含量 = 3.511ug 500 = 1755.5ug = 1.756mg 青菜的蛋白质

5、含量 = 5.507ug 500 = 2753.5ug = 2.754mg 即是说，1g 菠菜中含有 1.756mg 的蛋白质，即菠菜的蛋白质含量为 1.756；1g 青菜中含有 2.754mg 的蛋白质，即青菜的蛋白质含量为 2.754。 3.实验结果分析及讨论实验结果分析及讨论 青菜的蛋白质含量比菠菜的蛋白质含量高 1左右。 误差分析： A.标准曲线制作过程中，所测量的溶液用的是 1ml 的体系，这样溶液加多加少 本身会有一定的区别。所以配置标准液时，最好是由一个人操作，或至少由一 个人将一种溶液加完；还有就是测量的溶液体系最好可以在大一点，这样由操 作引起的误差可以降低一些。 B.在测定

6、吸光值时，需先将分光光度计打开预热，目的是稳定它的波长；因为 测量数据是分两步进行的，所以最好用同一台仪器测定。 C.吸光值测定时，最好是使用的同一个空白，因此在测完标准曲线的吸光值后， 要将空白留下来，后面测样品的吸光值时使用；也可以同时配置两个空白，分 两次使用。 D.样品研磨时，一定要研磨充分，才能使蛋白质提取充分，若两种样品研磨的 程度不同，那么提取蛋白质的程度也不相同，最后的结果也不具有可比性。3-3E.结果中所测吸光值都偏小，一般最好是落在曲线的中间部位，否则就会影响 测量的准确度，因此样品的稀释倍数最好可以适当减小，样品的测量体系也可 以适当增大。 建议： A.最好适当增大溶液测

7、量的体系，如增加到 5ml 或 10ml，一方面可以降低人为 操作引起误差的影响，另一方面测量时润洗和测量都有足够的材料，若是对测 量的结果不肯定，还可以用剩余的样品液再测一次。 B.标准曲线的绘制和样品的测量最好可以同时进行。静置的时间不同，显色反 应的程度也就不同了，若用同一个空白，在测量完标准液后，过一段时间再测 样品液，本身就存在有误差。所以，最好是先制备样品液的母液，然后标准液 和样品液的测量体系可以一同配置，最后一起测量，也有助于减少误差。 C.为了使蛋白质提取充分，可以适当增加离心的次数。 其他：为了安全使用离心机，有时可以不必太严格的遵照实验操作的要求， 比如此次试验，要求离心 4000r/min 10min，但所用的离心机最高转速在 4000r，在使用时，可以稍微降低转速（如到 3990r） ，稍微延长离心时间（如到 11-12min） 。最后所得到的结果是一样的。其实，在实验过程中，除了要注意实 验操作的规范以外，还需注意实验仪器、设备的安全使用，什么时候该严格遵 守操作规范，什么时候可以适当变通，在试验正式开始之前就要做好安排。