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1、发酵工程学科的进展 第四次奎国发酵工程学术计论套论文集可控裂解的产过氧化氢酶基因工程菌的构建段绪果，沈微，诸葛健(扛南大学工韭生物技术教育部重点实验室，工业微生物研究中心江苏无锡214036)摘要：通过PCR方法定点诱变并扩增得到温度敏感的T4噬酋体溶菌啐基因矿，与表达 载体pUCl9连接后转化E coli JMl09，得到重组菌株E coli JMl09(pUCl9一一)重组菌 在三角瓶中通过徭加IPTG诱导后，悬浮于裂解缓冲液buffer TE中，菌体在10rain内暧光 度由175迅速下降到025左右，成功实现了可控裂解。将带有SD序列的T4噬菌体溶苗 酶基目，插入pBVperA质牲pe
2、rA基因下游上，重组质粒pBV220-加rA一，转化E coli JMl09，得到可控裂解的产过氧化氢癣基因工程苗。该重组菌在升温诱导条件下，实现 了过氧化氢酵基因和溶菌酶基因的共表迭，发酵后成功实现了细胞的可控裂解。 关键谰：T4 溶菌酶，可控裂解；过氧化氢酶I温度诱导1引言大肠杆菌作为表达系统有许多优点o】：培养基便宜、容易培养、周期短。但是仍然存 在一些缺点；大肠杆菌为非分泌型宿主，其表达的外源蛋白大多为胞内产物，很难分泌到 胞外。目的重组蚤白在后续分离纯化前首先要破碎细胞，使内容物释放到胞外。目前使 用的破碎细胞的常用方法包括：弗氏压碎器、超声波破碎法、珠磨法、有机溶剂法、酶法以 及冻
3、融法等o】。这些方法在细胞破碎过程中产生的热量、表面张力及机械剪切力，往往 会对一些活性蛋白的活力产生影响o，甚至导致失活。 烈性噬菌体感染宿主细胞后借用寄主的代谢机器合成自身的DNA和蛋白质，然后 将这些DNA和蛋白质组装成许多新的噬菌体，再通过自身裂解系统实现对宿主细胞的 裂解，而释放出来，以后这些新的子代噬菌体又去感染附近的细菌，并将它们裂解，如此 反复。而温和噬菌体在侵入宿主细胞后，其DNA可以和宿主细胞的染色体整合在一起， 并与宿主细胞同步复制，一般情况下宿主细胞并不裂解，在升温或紫外诱导下噬菌体就 会裂解细胞H。基于噬菌体裂解机理的研究，目前已经开发出兰类利用嘴菌体裂解大肠 杆菌分
4、离胞内产物的方法口_1“：I利用烈性噬菌体直接感染发酵后的细胞使之快速裂 解j2构建溶源菌，在发酵后期通过升温或紫外线诱导实现细胞的裂解；3克隆噬菌体 裂解基因来裂解细胞。 研究发现T4噬菌体裂解基因包括溶菌酶(1ysozyme)编码基因e和穿孔素(holing) 编码基因tn3。T4噬菌体裂解大肠杆菌是在穿孔紊和溶菌酶协调作用下完成的。T4 溶菌酶是胞内酶，自身不能穿过细胞质膜，而穿孔素蛋白能够改变细胞质膜的通透性，使 得溶菌酶可以穿过细胞质膜进入周质空间，进而作用于细胞壁。本实验拟采用将T4噬 菌体裂解基因串联到含有过氧化氢酶的温控表达载体上，利用升温诱导的方法实现两种第四次全国发酵工程学
5、术讨论会基因的表达，发酵后将菌体悬浮于禽有EDTA的缓冲液中，利用EDTA来模拟穿孔素的 作用，实现细胞的可控裂解。2材料与方法2I菌种和质粒质粒pBV-perA的为本实验室构建并保存口”；含有野生型T4噬菌体溶菌酶基因e 的质粒pHSl403由美国Oregon州立大学霍华德休斯医学研究所的Brian WMatthews 教授赠送。pUCl9质粒购自华美生物工程科技有限公司。22培养基和培养条件LB培养基(gL)：蛋白胨10，酵母粉5，氯化钠10，pH 70。添加15琼脂为LB 固体培养基。使用前加入氨苄青霉素至100 pgmL。发酵培养基(gL)：无水葡萄糖10，(NH)2SO8，NaCI
6、3，KHzPq4，您HPO15， MgSO。01。微量元素溶液lmL。pH 70。 种子培养：采用新近转化和鉴定的菌株。菌种在含5 mL液体LB的试管中于30、200 rmin培养过夜，再按2的接种量转接一次，相同条件下培养4 h，作为活化的种 子。摇瓶发酵：取活化的种子以2的接种量接人装有50 mL LB或半合成培养基的250 mL摇瓶中，再按文献-121中的培养及诱导条件分别进行发酵。5L发酵罐分批培养：在5L台式机械搅拌发酵罐中装液量为3L，接人4的种子，消 泡剂添加量为o5 mLL。控制参数：(1)pH值；自动流加3moIL盐酸和3molL NaOH，使pH保持在70左右。(2)温度：
7、30C培养75h，然后迅速生温至42诱导培 养7h。(3)通气量及转速：空气流速3Lrain，转速控制在500rrain。23工具酶和试剂 实验所用的工具酶EcoR I、Pst I、碱性磷酸酶CIAP、T4 DNA连接酶、Taq DNA 聚合酶、Pyrobest DNA聚合酶、DNA分子量标准DL2000购自宝生物工程(大连)有限公 司；质粒抽提试剂盒、PCR产物(小量)纯化试剂盒、胶回收试剂盒均购自上海华舜生物工 程有限公司。裂解缓冲液：磷酸缓冲液(PBS，50mmolLpH 8o)；Buffer TE(2ramolL EDTA，50retoolL TrisCl，pH 8O)IBuffer
8、T(50mmolL TrisC1，pH 8O)。蛋白含量测定试剂：BradfordReagent购自上海生工生物工程公司；牛血清白蛋白 BSA为宝生物工程(大连)有限公司产品。24 DNA操作技术质粒DNA提取、纯化、酶切、连接，感受态细胞的制备、转化，重组菌的筛选、鉴定等 参照文献”3所述方法PCR产物纯化参照上海华舜生物工程有限公司小量PCR产物 纯化试剂盒操作说明。25T4噬菌体溶菌酶基因e的PCR扩增殛定点变异 根据GenBenk公布的T4噬菌体溶 菌酶基因e的序列“3以及文献资料“o上关于温段绪果等：可控裂解的产过氧化氢酶基因工程菌的构建度敏感变异位点，设计上游引物Pe一1和下游引物
9、Pe一2。利用PCR方法，以质粒 pHSl403为模板，利用高保真的Probest DNA聚合酶扩增含有T4噬菌体温度敏感溶茵 酶基因矿的DNA片段。上游引物Pe-1： 5一AATT塑旦曼垒鱼TTGGTTAAAAATTAAGGAGGGAATTCAT GAATATATTTGAAATG TTACG一3 下游引物n一2t5一AATTCTGCAGTTATAGATTTTTATACGCGTCCCAA 1AI TGCCAGTTCTAAACGTTG一326质粒的构建及重组菌的筛选 采用DNA胶回收试剂盒回收经过pstI酶切后的PCR 产物，并与pUCl9载体连接 后转化E coli jMl09感受态细胞，通过
10、蓝白斑鉴定挑出阳性转化子。提取阳性转化子 中的质粒进行PCR验证、EcoR I酶切验证以及测序验证。 验证正确的质粒经pstI酶切后，用DNA胶回收试剂盒回收经琼脂糖电泳后的目的片断。目的片断再与pst I酶切后的表达载体pBVperA连接后转化入Ecoli JMl09，在含氨苄青霉素的LB平板上涂布，30“C静置培养过夜，提取重组质粒，进行PCR 验证以及测序验证。 27粗酶液的制备和酶活测定 接种E coli JMl09(pBV-perA-e)于含有氨苄青霉紊100 pgmL的LB液体培养 基三角瓶，150 rmin振荡培养后离心收集菌体，用50 mmolL，pH 80的磷酸缓冲液 (PB
11、S)洗涤细胞两次，离心后将菌体悬浮于裂解缓冲液中，室温静置30min使细胞充分裂 解。然后利用旋涡振荡器振30s，使裂解液粘度降低，12，000 rrain离心10rnin，离心后 所得上清液即为粗酶液，用于目的酶蛋白分析和酶活测定。 发酵罐中发酵后的菌体经离心收集菌体，用50 mmolL，pH 80的磷酸缓冲液 (PBS)洗涤细胞两次，离心后将菌体悬浮于裂解缓冲液中，室温静置30min使细胞充分 裂解。然后在发酵罐中500rrain搅拌6min，使裂解液粘度降低，12，000 rrain离心 10min，离心后所得上清液即为粗酶液，用于目的酶蛋白分析和酶活测定o”。 28菌体浓度殛蛋白浓度的
12、测定菌体浓度用分光光度计在600 nm波长处测光密度值(OD6。)。蛋白浓度测定参照 文献1”。29裂解液粘度的测定 粘度测定参照数字式粘度计NDJ一5s使用说明。3结果与讨论31 T4噬菌体溶菌酶基因B的定点诱变由于野生型的T4噬菌体溶菌酶可以耐受一定的温度范围，在42条件下仍然具有 活性，可以降解细胞壁质；大肠杆菌在42时其细胞质膜会发生相变，对胞内蛋白形成一第四次全国发酵工程学术讨论会定的透过能力，因此胞内少量T4噬菌体溶菌 酶到达周质空间，降解肽聚糖，导致细胞过早 裂解死亡，难以积累目的产物。根据资料公布 的序列o“”，通过PCR定点诱变获得温度敏 感的T4噬菌体溶菌酶的序列片段。以含
13、有 野生型T4噬菌体溶菌酶基因e片段的质粒 pHSl403为模板，nl和P82为上下游扩 增引物，在Probest DNA聚合酶的作用下，扩 增得到结构基因片段矿，PCR产物经琼脂糖 电泳鉴定表明，在541 bp左右有一条明显的 带(图1)，与目的基因片段(含引物序列)大小 一致。32 pUCl9-e“载体的构建及酶切验证 M DL2000 markef，1矿的PCR产物为了圈1矿的PCRp物确认此扩 增产物是 定点诱变过的温度敏感T4噬菌体溶菌酶基因矿片段，将它直接连接到pUCl9载体上得到pUCl9一e4PstI (如图2所示)。然后转化大肠杆菌JMl09，在含氨苄 青霉素的蓝白鉴定平板上
14、检出白色转化子，提取质粒， 酶切电泳鉴定。如图3所示，酶切验证得到了正接的 重组质粒pUCl9一矿。对重组质粒pUCl9一矿上的e。片断进行测序测序公司为上海Sangon生物工程技 图2质粒pucl9一矿图谱 术服务有限公司。通过测序后的DNA序列分析，确 认了此PCR扩增片断为经定点诱变过的温度敏感T4 噬菌体溶菌酶基因矿片段。33E cell JMl09(pUCl9-e6 J裂解实验 取过夜 培养的种子以2的接种量接人装有50 mL LB培养基(含有10gmL氨苄青霉素)的250 mL摇瓶中，37，200rrain培养5h，然后加入IPTG 至浓度为lmmolL，继续诱导培养5h。发酵液在
15、8000rmin条件下离心3min，弃去上清后，将菌体悬 浮于裂解缓冲液buffer TE和buffer T中，如图4所，示，悬浮于buffer TE中的菌体的吸光度在5分钟内 MDL2000,1反接pUCl9一矿酶切由17迅速下降到04左右，然后吸光度下降速度有 产物，2-正接pUCl9一，酶切产物所降低，在第40分钟的时候苗体几乎完全裂解。而以 田3 pUCl9一，的酶切婆定结果buffer T为悬浮液的对照菌体没有发生裂解，因此其段绪果等，可控裂解的产过氧化氢酶基因工程菌的构建吸光度几乎没有变化。由此可以证明，通过添加含有穿孔素(holing)模拟物EDTA的buffer TE，可以很好
16、的实现对重组菌株Ecoli JMl09(pUCl9-e4)的可控裂解。十JTMI 09(pUGcts)悬浮于baffer T。1一JTMl 09(pUG-etj)悬浮-T-buffer TE圈4重组菌株E coll JMl09pUCl9-，)在裂解缓冲液吸光度的变化34 pBVperA一矿表达载体的构建及正反接验证为了在大肠杆菌中同时表达过氧化氢酶和T4噬菌体溶菌酶，构建了含嗜热脂肪芽 孢杆菌过氧化氢酶基因perA和温度敏感T4噬菌体溶菌酶基因e8的重组质粒pBv perAe4，其构建过程如图36所示。构建过程中，先利用Pst I单酶切质粒pBV perA，再用碱性磷酸酶CIAP对线性质粒去磷酸化。同时用Pst
