《四种禽类Sox8基因部分cDNA序列的克隆及其PCRSSCP分析》由会员分享，可在线阅读，更多相关《四种禽类Sox8基因部分cDNA序列的克隆及其PCRSSCP分析（43页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、东北农业大学硕士学位论文四种禽类Sox8基因部分cDNA序列的克隆及其PCR-SSCP分析姓名：夏彦玲申请学位级别：硕士专业：动物遗传育种与繁殖指导教师：刘娣2003.6.1撩要辅覃I q 7 fS o x 基因家族是一类转录因子家族，它的特征是具有一个保守的基 - I - I M G b o x ， 它可以与D N A 特异性结合。S o x 基因在胚胎发育及成年期都起着重要作用。S o x 8 基因是该家族中一个优质亚族E 亚族中的一个成员，S o x 8 基因由三个外显子和两个内含子组成，是最近才得到鉴定的基因( S e h e p e r s ，G E ，e ta 1 2 0 0 0
2、) 。该基因突变可导致先天性的发 育缺陷，但S o x 8 基因缺陷鼠可正常存活和繁殖，只是体重显著降低，尤其是脂肪含量，可能是由于能量稳态及调控的改变等原因造成的，例如食物利用率降低或能量分配不当 等，所以对它的研究在禽类的育种中有重要的理论意义和实际意义。 1 0 0 k b ) 且无降解，则在加样孔附近呈现一致密的亮带，如有降解，则呈连续分布状态，若严重降解则看不到大片段的D N A ，只能在远离加样孔 处见到弥散状D N A 。2 3 6 引物的合成与设计P C R 技术是一种体外扩增D N A 或R N A 片段的方法，P C R 引物设计的目的是找到 一对合适的核苷酸片段，使其能有
3、效地扩增模板D N A 序列，引物的优劣直接关系到P C R 特异性扩增的成功与否。引物的设计应遵循以下原则： 1 长度典型引物长度为1 8 2 4 b p ，引物需要足够长，保证序列特异性，大于2 4 个核 苷的引物并不意味着更高的特异性，较长的引物更易发生错配。降低了特异性，而且比 短序列杂交慢，从而降低了产量。引物的有效长度：L n - - 2 ( G 屺) + ( A + T ) ，L n 值不应 超过3 8 ，因为大于3 8 时，最适延伸温度会超过T a qD N A 聚合酶的最适温度( 7 4 ) ，不 能保证P C R 产物的特异性。 2 G + C 含量G + C 含量一般为4
4、 0 - 6 0 ，T m 值与G + c 含量有关，引物中四种碱基最1 4lUUUp筠021材料与方法好是随机分布，不要有连续的聚嘌呤和聚嘧啶存在，尤其是3 端不应超过三个连续的G 或C ，这样会使引物在G + C 富集区错误引发，应保证最后5 个核苷酸中含有3 个A 或T ， 最好设计5 端和中间区为G 或C ，这会增加引物的稳定性和引物同目的序列杂交的稳定性。3 引物自身引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构或引发本身复性，这会破坏引物退火稳定性，另外一定要避免3 末端的错误配对，因3 末端需要同模板退火以供聚合酶催化延伸，目的序列上并不存在的附加序列，如限制性酶切位 点
5、和启动子序列，可以加入到5 端而不影响特异性。根据G e n B a n K 上发表的鸡的S o x 8 基因c D N A 序列，利用引物设计软件p r i m e r s 0 设计了 三对引物克隆四种禽类的S o x 8 c D N A ：引物上游5 一3 下游5 一3 第一对( 卜1 5 6 9 ) h T GC T CA A Ch T OA C CG A GG AG T TT C A 从GC A bG G GG A CA c第二对( 卜9 7 0 ) A T GC T C 从CA T GA c cG A GG AC C GA G TG G GA G TA G Gh C G毽三翌丝! ：
6、! ! ! ! ! 坚塑! 坠! 坠墅型!堕! 竺坐唑堂堂竖同时设计了七对引物对六个地方鸡种进行了单核苷酸多态性分析，片段扩增了1 4 2 8 b p ( 包括一小部分3 末端) ，覆盖大约9 8 的编码区。由大连宝生物工程公司合成。型塑占堂! ：! ：王堂! ：! ： 第一对( 1 - 2 0 1 )m m 从ch T G 戕啪“6 6 cc G c mC A C m G第Z - 对( 2 0 0 - 4 4 6 )C C GA 6 6T G GA c GA 6 C6 c G cC A GA G C mc c 第三对( 4 5 0 - 6 3 4 ) h A GC G AA T G hG A
7、 AA C GT G TC A Gc c rT G TA G A 研G G第四对( 7 1 1 - 6 5 1 )C A CG A Cc c cC A AA A CT G Am 偈A T GA C CT C 6C T GC第五对( 8 3 6 。1 0 3 9 )G c GA G 6T c AT C A 枞 c Tc c G T 6 c GG c GA T GC第六对( 1 0 3 3 1 2 5 9 ) T C AT C GG O “ G A TT C GGG G AT A GG G GT T GT A GT A Gm 点塑幽：譬：坚塑业坚雹坚坚竖堡g 篮翟磐唑2 3 7R T P C R
8、反应2 3 7 1 逆转录反应R _ N AP C RK i t ( A M V ) V e r 2 1 ( 大连宝生物工程有限公司)1 0 x R N AP C Rb I 诳打2 山R i l a s eF r e ed H 2 08 5 山 d N T PM i x ( 各1 0 m l v l )2 山R n a s eI n h i b i t o r0 5 u 1 A M VR e v e r s eT r a n s c r i p t a s e1u JO l i g od T - A d a p t o rP r i m e rl u JR N A ( 1 “g ，)l 山T
9、o t a l2 0 I _ d S a m p l e反应条件2 3 7 2P e R 反应4 5 9 9 5 3 0 m i n5 m i n一个循环5 m i n以逆转录反应得到的c D N A 为模板，第三对引物的P C R 反应体系1 0 x P C Rb u f f e r 1 0 m Md N T PM i x2 5u l2 O u lP r i m e r ( F ) 1 0 p m o V 山1 O u lP r i m e r ( R ) 1 0 p m o L m1 O 山T a qD N Ap o l y e r a s e0 2 出T e m p l e tc D N
10、 A1 0 u 】A u t o c l a v e d ，d i s t i l l e dw a t e r1 7 - 3 山T o t a l2 5 且出P C R 反应条件9 5 9 5 6 4 I 7 2 G o t o27 2 4 1 0 m i nl m i nl r a i n1 m i n3 5 c i r c l e1 0 r a i n3 0 m i n1 6材料与方法2 ，3 7 3R T - P C R 扩增产物的电泳检测与鉴定取P C R 产物30 山上样于l 的琼脂糖凝胶上，同时在另一点样孔加5 P l D N AD L 2 0 0 0M a r k e r 作参
11、照，1 0 0 V 恒压电泳1 小时，E B 染色并在计算机凝胶成相系统上观察，如果 存在扩增片段大小与设计相符的条带，即可进行下一步的操作。2 3 8P C R 反应( S S C P 分析)( 1 ) 反应体系：组分1 0 P C Rb u f f e r 1 0 m Md N T PM i xP r i m e r ( F ) 1 0 p m o U l l lP r i m e r ( R ) 1 0 p m o l p lT a qD N Ap o l y e r a s eT e m p l e tD N AA u t o c l a v e d ，d i s t i l l e
12、dw a t e rT o t a l2 5 p l2 0 u l1 0 u l1 0 u l0 2 山3 0 u J1 5 3 u l2 5 0 u l( 2 ) 反应条件第二对第三对第四对第五对第六对第七对9 5 5 m i n9 5 5 m i n9 5 5 m i n9 5 5 m i n9 5 5 m i n9 5 5 m i n9 5 3 0 s e c9 5 3 0 s e c9 5 3 0 s e c9 5 3 0 s e c9 5 3 0 s e c9 5 3 0 s e c6 0 9 3 0 s e c 5 5 8 3 0 s e c5 8 5 3 0 s e e6 0 2
13、 3 0 S E E5 3 6 “ C3 0 s e e5 58 “ C3 0 s e c7 2 3 0 s e c7 2 3 0 s e c7 2 3 0 s e c7 2 3 0 s e c7 2 3 0 s e c7 2 3 0 s e cG 0 1 ：0 23 5 c y c l e sG o t 0 23 5 c y c l e sG o t 0 23 5 c y c l e sG o t 0 23 5 c y c l e sG o t 0 23 5 c y c l e sG o t 0 23 5 c y c l e s7 2 1 0 = i n7 2 1 0 r a i n7 2
14、1 0 r a i n7 2 1 0 m i n7 2 1 0 = i n7 2 1 0 m i n4 “ C3 0 = i n4 3 0 = i n4 “ C3 0 r a i n4 3 0 r a i n4 3 0 m i n4 3 0 = i n( 3 ) P C R 扩增产物的电泳检测及鉴定取P C R 产物3 山上样于1 琼脂糖凝胶。同时在一点样孔中加3 0mD N AD L 2 0 0 0M a k e r 作对照，电泳2 0 - 3 0 r a i n ，在计算机凝胶成像系统上观察，如果P C R 产物无其它杂 带，且扩增片段大小与设计相符，就可以用于S S C P 分析。2 3
15、 9P C R 产物的纯化1 刷洗制胶及电泳用的所有用具( 避免其它D N A 的污染) 。 2 电泳。1 73 在紫外灯下切特异性片段，切下的胶要尽可能的小。4 称重，按l ：3 的比例加入s 1 液。5 5 0 “ C 水浴l O m i n ，使琼脂糖完全融化，每2 m i n 颠倒混匀一次。6 将融化后的琼脂糖液移入吸附柱，离心1 m i n 倒掉收集管中的液体，再将吸附柱放入同一个收集管中。 7 向吸附柱中加入5 0 0 P - I W I 液，离心1 5 s e c ，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中( 如果室温低于2 0 “ C ，离心前先静止l m i n ) 。
16、 8 向吸附柱中加入5 0 0 9 l W l 液，静止l m i n 后，离心1 5 s e e 。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。9 离心I m i n 。1 0 将吸附柱放入一个干净的1 5 m l 的E P 管中，在吸附膜中加入2 0 q T l 液，静止1 r a i n 后，离心l m i n ，将1 5 m l 的E P 管( D N A ) 保存于- 2 0 。2 3 1 0 连接反应( 1 ) 将纯化好的D N A 片段与P M D l 8 - T 载体建立以下的连接反应体系：T 1 8v e c t o r0 5 1 dS o l u t i o n4 ，5 p lD N A5 , 0 山T o t
