《以DNA为基础的复合免疫接种诱导小鼠抗AMAl免疫应答》由会员分享，可在线阅读，更多相关《以DNA为基础的复合免疫接种诱导小鼠抗AMAl免疫应答（92页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、第四军医大学博士学位论文以DNA为基础的复合免疫接种诱导小鼠抗AMAl免疫应答姓名：李珣申请学位级别：博士专业：病原生物学指导教师：薛采芳2003.4.1猿麓憾奢一s n s 2 3秉承q - 校严谨的q - 风- 5 优良的科q - 道德，本八声明所呈交的论文是莪个在导师指导下遗行的研究工作及取得的研究威果。尽拢所知，除了文中特别以标注和致谢的地方9 ，论文中不包含其他八已经发表或撰写过的研究威；不包含本人或他人已申请学位或其他用途使用过的成果。与莪一同工作的r 4对本研究所傲的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了致谢。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。论文作者签名
2、：盔! 复日期I 麓羹产麓奢_本人完全了解第四军医大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在校攻学位期同论文工作的知识产积单位屠第四军医大学。本八保证毕业离较后，表论文或使用论文工作成果时署名单位仍然为第四军医大学。学校有权保留交论文的复印件，允许论文被查阋和借阅；学校可以公布论文的全部或部分容( 保密内容除， ) ，可以采用影印、缩印或其他复嗣手段保存论文。论文作者签名誊伺嗍各：鞯腿趁王zA D c I掣1 b o d y 如p e n 血mo 。1 1 删d 1 眦di m m u n i t yA M A lA p i c a lm e m b r a n ea n t i g e nlA
3、 m pA m p i c i l l i nA P CA n t i g e np r e s e n tc e l lB C AB i c i n c h o n i l l i ca c i dB G HB o v i n eg r o w t hh o r m o n eB H K 2 1B a b yh a m s t e rk i d n e yc e l l2 1B S AB o v i n es e r u ma l b u m i nC E FC h i c k e ne m b r y of i b r o b l a s tC M IC e l l u l a rm e
4、d i a t e di m m u n i t yC M VC y t o m e g a l o v i r u sC o n AC o n c a n a v a l i nAC S PC i r c u m s p o r o z o i t cp r o t e i nC T LC y t o l y t i cTl y m p h o c y t eD A BD i a m i n o b e n z i d i n eD CD e n d r i t i cc e l lE B AE r y t h r o c y t eb i n d i n ga n t i g e nE c
5、 o iE s c h e r i c h i ac o l iE D T AE t h y l e n ed i a r r l i n e t e t m a c e f i ca c i dE L I S AE n z y m e l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y抗体依赖细胞介 导的免疫顶端膜抗原l氨苄青霉素抗原提呈细胞双喹啉甲酸牛生长激素幼鼠肾细胞2 1牛血清白蛋白鸡胚纤维母细胞细胞介导的免疫巨细胞病毒伴刀豆球蛋白A环子孢子蛋白溶细胞性T 淋巴 细胞二氨基联苯胺树突状细胞红细胞结合抗原大肠杆菌乙二胺四乙酸酶联免疫吸附实 验4第四
6、军医大学博士学位论文墓塞塑! ! ! 堕M NM S PM u S t D OM V AM WN CN C SN T AO DO D N0 R FP A G EP bP B SP cP jP F AP 七P L GP M B CM o n o c y t eM e r o z o i t es u r f a c ep r o t e i nM u l t i - S t a g eM a l a r i aD N AV a c c i n eO p e r a t i o nM o d i f i e dv a c c i n i av i r u s 丸n k a r aM o l e c
7、 u l a rw e i g h tN i t r o c e l l u l o s eN e w b o r nc a l f s e r u mN i t r i l o t f i a c e t i ca c i dO p t i c a ld e n s i t yO l i g o d e o x y n u c l e o t i d eO p e nr e a d i n gf r a l n eP o l y a e r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i sP l a s m o d i u mb e r g h
8、e iP h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n eP l a s m o d i u mc h a b a u d iP l a s m o d i u m f a l c i p a r u mP a r a f o r m a l d e h y d eP l a s m o d i u mk n o w l e s iP o l y l a c t i d e - c o g l y c o l i d eP e r i p h e r a lm o n o n u e l e a rb l o o dc e l l单核细胞裂殖子表面蛋白多阶段疟
9、疾D N A 疫苗行动改良的安卡拉痘 苗病毒分子量硝化纤维素新生牛血清腈三乙酸光密度寡脱氧核营开放阅读框聚丙烯酰胺凝胶 电泳伯氏疟原虫磷酸盐缓冲的生 理盐水夏氏疟原虫恶性疟原虫多聚甲醛诺氏疟原虫多聚交酯外周血单个核细 胞6P R B CP SR B CR K l 3r p mS H I VS IS S D ST C I DT e r m T hT M B1 N FT P AT R A PT r i sP a r a s i t i z e dr e db l o o de e l lP e n i c i l l i na n ds t r e p t o m y c i nR e db l
10、o o de e l lR a b b i tk i d n e yc e l l1 3R e v o l u t i o np e rm i n u t eS i m i a nh u m a ni m m u n o d e f i c i e n c yv i r u sS t i m u l a t i n gi n d e xS i m i a ni m m u n o d e f i c i e n c yv i r u sS o d i u md o d e c y ls u l f a t eT i s s u ec u l t u r ei n f e c t i o nd
11、o s eT e r m i n a t o rT h e l p e r3 , 3 ，5 ，5 - T e t r a m e t h y l b e n z i d i n eT u m o rn e c r o s i sf a c t o rT i s s u ep l a s m i n o g e na c t i v a t o rT h r o m b o s p o n d i n - r e l a t e da n o n y n o u sp r o t e i nT r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t
12、 h a n e原虫感染的红细胞青霉素和链霉素红细胞兔肾细胞1 3每分钟转数猿人免疫缺陷病 毒刺激指数猿免疫缺陷病毒十二烷基硫酸钠组织培养感染剂 量终止子T 辅助细胞3 ，3 ，5 ，5 - 四甲基联 苯胺肿瘤坏死因子组织纤溶酶原激 活物血栓海绵蛋白相 关的未命名蛋白三( 羟甲基) 氨基 甲烷7第四军医大学博士学位论文摘要以D N A 为基础的复合免疫接种诱导小鼠 抗A M A l 免疫应答摘要疟疾仍然是危害人类健康的严重传染病，有效的疫苗将为防止疟原虫 感染、减少疟疾发病和阻断蚊媒传播提供重要的手段。D N A 疫苗是一种全 新的疫苗形式，具有简单、稳定和灵活多样的突出特点，可诱导包括细胞
13、和抗体在内的多种免疫应答。细胞因予在免疫应答过程中具有重要的作用， 编码细胞因子的质粒D N A 可有效促进和调节D N A 疫菌所诱导的免疫应 答。用D N A 进行初始免疫，用重组蛋白或重组减毒痘病毒进行追加免疫 的初始强化免疫方案可选择性地增强由D N A 免疫所诱导的免疫应答，提 高D N A 疫苗的保护效能。A M A l 是红内期疟疾疫苗的重要候选抗原，抗 体在针对A M A l 的保护性免疫中发挥着关键作用。本研究选择A M A l 的 胞外域片段作为疫苗靶向，制备了包括重组蛋白、质粒D N A 和重组M V A 在内的三种不同形式的原型疫菌，在分析各种疫苗免疫特性的基础上，采
14、用D N A 加细胞因子编码质粒进行初始免疫，用重组蛋白和重组M V A 按不 同的顺序进行追加强化，探讨了不同免疫方案在增强小鼠抗A M A I 抗体应 答中的作用。 首先，自P 厂基因组D N A 中扩增出编码A M A I 胞外域的基因片段，经 测序确证后，克隆入原核表达载体。构建了可分别表达A M A I 完整胞外域 蛋白和不同亚结构域蛋白的系列重组表达载体，包括：p E T - 1 6 b E 、p E T - 1 6 b l + I I 、p E T - 1 6 b l 、p E T - 3 0 a ( + ) I I 和p E T - 3 0 a ( + ) I I I 。转化E
15、 c o l iB L 2 1 D E 3 菌，经诱导后表达出各个重组蛋白。用变性剂溶解包涵体蛋白，经 N i - N T A 琼脂糖纯化后在适宜的条件下进行熏折叠复性。用重组蛋白加福氏 佐剂经腹腔接种免疫B A L B c 小鼠，制备抗血清，采用免疫荧光和免疫印 迹的方法鉴定抗血清的识别特性，用小鼠免疫血清进行疟原虫体外生长抑 制实验，分析重组蛋白与保护性抗体应答之间的关系结果表明，A M A l 胞外域蛋白结构的完燕性对于保护性抗体的诱导至关重要。 在蛋白免疫实验的基础上。本文选择编码A M A l 完整胞外域的基因片 段，构建了D N A 免疫质粒V R l 0 2 0 ，E 用1 0
16、0 腿的荆量经肌肉接种B A L B c 小鼠，两次免疫后，诱导出明显的A M A l 特异的抗体和脾细胞增殖。构建 小鼠细胞因子表达质粒p e D N A 3 G M - C S F 和p c D N A 3 1 ( ) I L _ 4 ，以及双表 达质粒p G M - C S F p T P A - E ，用细胞因子表达质粒分别与V R l 0 2 0 E 共同免疫 小鼠，分析细胞因子质粒对A M A lD N A 免疫的调节作用。结果表明，各 种细胞因子质粒均显著促进了小鼠针对A M A l 的抗体和细胞应答，0第四军医大学博士学位论文摘要G M C S F 质粒和I L 1 2 质粒分别显著促进了T h 2 型和T h l 型的免疫应答。 M V A 是高度减毒的痘苗病毒株，利用重组M V A 可诱导针对多种病原 体和肿瘤细胞的免疫应答。本文构建了基因转移载体p I I I d H R s s p E ，经同 源重组后筛选获得可稳定表达A M A I 蛋白的重组病毒r M V A f E 。用1
