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1、重组鲎重组鲎 C 因子因子 sushi 蛋白中内毒蛋白中内毒素结合位点的确定和素结合位点的确定和 sushi 多肽对多肽对内毒素的中和作用内毒素的中和作用NGUAN SOON TAN,* MIANG LON PATRICIA NG,* YIN HOE YAU,*POOI KAT WILLIAM CHONG,* BOW HO, AND JEAK LING DING*,1*Department of Biological Sciences, Department of Microbiology, National University of Singapore, Singapore 117543摘
2、要摘要：作为生物活性分泌重组蛋白产生的 C 因子，含有不同的 sushi 蛋白结构 域，其三个截短的片段分别为 sushi 123，sushi 1 和 sushi 3 结构域。sushi 1 和 3 各有一个 Kd 102910210 M 的高亲和力 LPS 结合位点，sushi 123 的正协同效应 会在 Kd 2 中增加 1000 倍。sushi 1 和 3 的核心 LPS 结合区域存在于两个 34-mer 肽，S1 和 S3 中。一个二硫键结构的牢固结合不是必需的，但是对于 LPS 结合 是十分重要的，正如所确认的亲和性下降了 10010000 倍。S1 和 S3 都能以不 同的效价，抑
3、制 LAL 反应和 LPS 诱导的 hTNF- 的分泌。LAL 试验显示，至少有 两分子的 S1 按 2.42 的 Hill 系数共同结合到一个 LPS 分子上，而被 S3 结合的 LPS 则是独立进行，无需协同的。经过修饰的 SD1 和 SD3 肽展现出增强的 LPS 中和潜能，尽管它的亲和力只表现出 10 倍的提高。因此，在不改变它们对 LPS 的结合亲和力的条件下，四个 sushi 多肽的结构差异赋予了 LPS 不同的中和作 用效率。圆二色谱测定显示出类脂 A 中存在四肽构象的变化，即从一种无规卷 曲转变成 螺旋或 折叠结构。C 因子对 LPS 的灵敏度有两个关键因素：1)单 个的 C
4、因子分子上存在多个 LPS 的结合位点；2）LPS 结合的高正协同效应。 结果表明，在改进 LPS 的结合和中和肽的设计中，除了它的结构之外，其电荷 平衡也是一项关键参数。关键词关键词：鲎变形细胞溶解物；类脂 A；果蝇 S2 细胞；脂多糖内毒素也被称为脂多糖(LPS)，它是革兰氏阴性菌外层的主要组成部分，并 具有重要的病理生理功能。在被革兰阴性细菌感染时，LPS 是宿主防御系统的 体液免疫和细胞组分的重要激活剂，激活宿主防御来对抗这类感染是有必要的， 但不受控制的刺激可能导致过度地释放炎症细胞因子，引起感染性休克和死亡。由内毒素的中和作用介导的毒性损伤，在很长时间内一直被认为是可能的治疗 患者
5、的药物作用靶点。在 LPS 分子中，存在三种遗传特性、生化特性和抗原性 不同的区域：O-特异多糖侧链、核心多糖和类脂 A。O-特异侧链由高度可变的 重复低聚糖单位组成，它具有免疫原性，并能产生大量的血清，当 O-抗原丢失 时核心糖脂将会暴露，虽然在结构上相比 O-抗原的可变性较低，但它仍然出现 在许多类型的肠杆菌科细菌中（例如，沙门菌属）。LPS 的促炎症生物活性存 在于结构上最保守的葡萄糖胺基的磷脂上，即类脂 A。因此，内毒素的中和作 用通过类脂 A，体现了一个治疗这种复杂的临床综合症，合理的、多层面途径 的重要方向。我们在鲎变形细胞溶解物(LAL)中发现，溶液中只要有微量的 LPS 就可以
6、 激活凝血级联。三种丝氨酸蛋白酶原 C 因子、B 因子、凝血酶原和一种凝 固蛋白、凝固蛋白原已经被纯化并赋予某些特征。当 LPS 存在时，对 LPS 敏感的 C 因子，丝氨酸蛋白酶原会自催化激活，然后激活的 C 因子能够激活 B 因子酶原以激活 B 因子，随后激活凝血酶原以激活凝血酶，由此产生的凝血酶 会将可溶性的凝固蛋白原（一种无脊椎动物的纤维蛋白原样物质）转换为不溶 的凝固蛋白凝胶。作为凝血级联的最初激活物，C 因子的功能是作为一个生物 传感器，来响应 LPS 或类脂 A。可想而知，C 因子具有的 LPS 结合域展示出了 对类脂 A 的异常高亲和性。所以，来自于 C 因子的 LPS 结合域
7、将会结合并中 和类脂 A 的生物毒性，并能与其他细菌的 LPS 发生交叉反应，因此可应用于感 染革兰阴性细菌的败血症患者的免疫治疗。我们的实验室已经从Carcinoscorpius rotundicauda (CrFC)中克隆出与 C 因子同 源的 cDNA。C 因子是一种新型的包含 5 个 sushi 结构域的镶嵌蛋白，分别为一 个表皮生长因子样、一个 C 型凝集素样和一个丝氨酸蛋白酶的结构域。除了这 些结构域，一个富含半胱氨酸和一个富含脯氨酸的区域，也分别在 H 链的 NH2 末端和 COOH 末端被发现(图 1)。最近，我们已经建立了带有多个类脂 A 结合 位点的 CrFC 的氨基末端片
8、段，还表达并赋予了一种分泌型 CrFC 的氨基末端区 域一些特征，称为 SSCrFCES。这种 38kDa 的蛋白质表现出了 C 因子的 LPS 结 合域的高亲和力，并以 2.2 的 Hill 系数展现出与多个类脂 A 分子结合的高正协 同性。SSCrFCES 能够抑制内毒素诱导的 LAL 凝血反应，以及 LPS 诱导的由 THP-1 和正常人外周血单核细胞产生的细胞因子肿瘤坏死因子-（TNF-）和 白细胞介素-8。这一 C 因子的区域，包括了富含半胱氨酸、表皮生长因子样和 C 因子的三个 sushi 域，可防止半乳糖胺致敏的小鼠因受 LPS 诱导致死。sushi 域，也称作 2-糖蛋白 I
9、类结构域，含有两个二硫键。在本研究中，我们试图进 一步定位和评估通过表达 SSCrFCES 的小功能 sushi 域，以及来源于 SSCrFCES 的合成多肽，所获得的多个内毒素结合位点。我们还测定了由多肽介导的对 LPS 诱导 LAL 的抑制作用，以及人类 THP-1 细胞对 LPS 诱导 TNF- 分泌的抑 制作用，并使用圆二色谱(CD)分析研究了多肽的结构活性关系。最后，我们评 估了这些肽对半乳糖胺致敏的小鼠对抗致死内毒素攻击所提供的保护作用。材料与方法材料与方法试剂试剂图 1 A）C 因子的域结构以及截短的 C 因子表达载体。PAc5/SSCrFCES-V5- His 可产生 SSCr
10、FCES 蛋白。SSCrFCES 截短片段的相对位置已作为开放盒举例说 明。我们通过 PCR 得到了一个 sushi123 的片段。我们进行了由 1PCR 缓冲液 组成的总量为 100 mL 的 PCR 反应；200mM dNTPs、0.3mM 引物、10ng DNA 模板和 1 单位的 Vent DNA 聚合酶(NEB 公司)，PCR 的最佳条件为 s123 正向引 物(59-GGAGATCTGGTGCACTGTGAAATTCTC-39)和 s123 反向引物(59- GCACCGGTCTGTCACAGTCGACCTCT-39)，反应条件为变性（94，5 分钟） 、退火（50，1 分钟）和延
11、伸（72，1 分钟）。在最后一次延伸（72，5 分钟）前，这些条件将会再重复 30 个周期。B)我们运用抗 GFP 抗体（试剂盒）进行免疫印迹分析，并使用 SuperSignal 化学发光法使其可视化。代表 49、35、35 和 27 kDa 的特定条带分别对应着 sushi123-EGFP、sushi1-EGFP、sushi-3EGFP 与控制型 EGFP，可确定它们为仅有的被分泌和纯化的带有多组氨酸标签的蛋白质。我们使用 Biomax 胶卷（柯 达）的曝光时间只限于 5s。以下是已鉴定出的泳道：1 基准：预染的蛋白质标 准分子量（Gibco，BRL）；2 SSEGFP 培养基；3 sush
12、i123-EGFP 培养基；4 sushi1-EGFP 培养基；5 sushi3-EGFP 培养基 ；6 重组 GFP 控制线（0.1 g）。C)12%的考马斯亮蓝染色，降低了初始和部分纯化的 sushi:EGFP 蛋白的 SDS-PAGE 轮廓。用阴离子交换色谱法纯化的融合蛋白可占总蛋白 60-80%，这 些部分纯化的融合蛋白，可与抗 GFP 抗体联合用于 SPR 研究。以下是已鉴定 出的泳道：1 基准：预染的蛋白质标准分子量（Gibco，BRL）；2 控制培养基 （20 g）；3 初始 sushi123 培养基（20 g）；4 部分纯化的 sushi123 培养基（1 g）；5 初始 su
13、shi1 培养基（20 g）；6 部分纯化的 sushi1 培养基（1 g）；7 初始 sushi3 培养基（20 g）；8 部分纯化的 sushi3 培养基（1 g）。从 Escherichia coli 055:B5、E.coli f583、S. minnesotare 595、S. typhimurium s1684 和 S. flexneri 中所得的 LPS 和类脂 A（4-单磷脂酰-及 1,49-焦磷酰形式） 购自于 Sigma 公司（圣路易斯，密苏里州）；而从 E. coli K12, D31me 中所得的 类脂 A 来自于 List 生物实验室公司（坎贝尔，加利福尼亚州）。果蝇
14、表达系统 和培养基来自 InVitrogen 公司（圣地亚哥，加利福尼亚州）。LAL 试剂获赠于 BioWhitaker 公司（沃克斯维尔，马里兰州）。用于 LPS 刺激研究和昆虫细胞 检测潮霉素的培养基来自于 Gibco, BRL（格兰岛，纽约州）。低内毒素确定的 胎牛血清(FBS)是从 Hyclone 公司（洛根，犹他州）购买的。用于激活 THP-1 细 胞的佛波酯(PMA)和半乳糖胺分别来自于 Sigma-Aldrich 公司（费尔劳恩，新泽 西州）和 CalBiochem 公司（圣地亚哥，加利福尼亚州）。用于 TNF- 的免疫 分析法从 PharMingen 公司（圣地亚哥，加利福尼亚
15、州）购买。用于细胞毒性分 析的 Cell Titer 96 Aqueous 来自于 Promega 公司（麦迪逊，威斯康辛州）。纯化 GFP 蛋白从 Clontech 公司（帕洛阿尔托，加利福尼亚州）购买。寡核苷酸由 Genosys 生物技术公司（伍德兰，得克萨斯州）合成。用于 DNA 操作和聚合酶 反应的酶从 NEB 公司（贝弗利，马萨诸塞州）和 Boehringer Mannheim 公司 （曼海姆，德国）购得。所用的 DNA 纯化试剂盒来自于 Qiagen 公司（查特斯 沃思，加利福尼亚州）。用于配制缓冲液的无热原水来自于 Baxter 公司（莫顿 格罗夫，伊利诺伊州）。多肽多肽C 因子
16、介导产生的多肽由 Genemed 合成公司（旧金山，加利福尼亚州）合 成与纯化。第一条多肽（9N9- GFKLKGMARISCLPNGQWSNFPPKCIRECAMVS S-9C9）与 CrFC 氨基末端的第 171204 个残基一致，把其定名为 S1 (171204)， 其分子量MW为 3758。第二条多肽 (9N9HAEHKVKIGVEQKYGQFPQGTEVTYT CSGNYFLM-9C9)与第 268301 个残基一致，把其定名为 S3 (268301)，其分子 量为 3892。两处赖氨酸突变分别被引入 S1 和 S3，引起 S1(171204177,179) MW, 3727和 S3(268301276,278) MW, 3962。这些多肽的纯度都大于 95%。分泌的分泌的 sushi:EGFP 融合蛋白的结构融合蛋白的结构pAc5.1S123EGFP、pAc5.1S1EGFP 和 pAc5.1S3EGFP 分别包含了 CrFC 的 sushi 123、sushi 1
