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1、 高效液相色谱法高效液相色谱法及在水质分析中的应用及在水质分析中的应用（一）概述高效液相色谱法（High performance liquid chromatography，HPLC），又称高压液相 色谱法（High pressure liquid Chromatography），是 60 年代末 70 年代初发展起来的快 速分离分析方法。其基本流程与气相色谱法相似，只是以高压输液系统代替气相色谱的气路 系统。高效液相色谱法与气相色谱法相比，显著优点是样品的适用范围宽。气相色谱法虽然 也具有快速、分离效率高、样品用量少等优点，但分析的样品必须能够气化。在所有的化合 物中可以直接用气相色谱法分析
2、的物质只占约 20。而高效液相法只要求样品能制成溶液 而不需要气化，因此不受样品挥发性和热稳定性限制。能用高效液相进行分析的物质占有机 物总量的 7580。因高效液相具有适用范围广、分高效率高、速度快、灵敏度高、流动 相可选择范围宽、色谱柱可反复应用、流出组分容易收集、安全及操作自动化程度高等特点 而较广泛应用于各种分析领域，也是环境和卫生检测常用的极其重要的分析手段。（二）基本原理高效液相色谱法与经典柱色谱法的原理相同。溶质在固定相和流动相之间进行连续多次 的交换过程，由于每种物质在两相间的分配系数、亲合力、吸附能力、离子交换或分子大小 不同引起的排阻作用等的差别而得到分离。气相色谱中引入的
3、一些基本概念和理论，结合液 相色谱的实际，稍加改变仍可使用。（三）高效液相色谱法分类根据分离机理，高效液相可分为液一液分配色谱法、液一固吸附色谱法、离子交换色谱 法和空间排阻色谱法四类。（l）液液分配色谱法液一液分配色谱法是根据各组分在固定相和流动相之间分配系数的差异进行分离的。早 期所用的固定相是将固定液涂渍在惰性担体上，固定液容易流失。现时的固定相一般采用键 合固定相，即用化学反应的方法将固定液的官能团结合到担体上，克服了固定相易流失和污 染分离组分的缺点，从而得到了广泛应用，所以现时液一液分配色谱又称化学键合相色谱。 它又可分为极性键合相色谱和非极性键合相色谱。极性键合相色谱又称正相色谱
4、，其固定相 表面键合了极性有机基团如氰基、氨基、双羟基等，流动相多用非极性或弱极性溶剂，适于 分离极性化合物。非极性键合相色谱又称反相色谱，其固定相表面都是极性很小的烃基如十 八烷基、辛烷基、甲基、苯基等，而流动相则大多采用强极性的溶剂（如水、甲醇等）或无 机盐的缓冲溶液。反相色谱不仅适合于分离非极性物质，而且具有通用型液相色谱的特点， 分析对象几乎遍及各种类型的化合物，在化学键合相色谱中绝大部分属于这种类型。（2）液一固吸附色谱法 液一固吸附色谱法是根据各组分在吸附剂（固定相）上吸附能力的差异进行分离的。所 用的固定相多是具有吸附活性的吸附剂，常用的有硅胶、高分子多孔小球以及氧化铝、分子 筛
5、、聚酰胺等。液固吸附色谱的分离对象主要是具有中等分子量的低挥发性化合物，非极性 或中等极性的、非离子型的油溶性样品。 液固色谱的应用受到如下限制：难于获得具有良好重现性的吸附剂；吸附剂由于不 可逆吸附或催化作用，会使样品损失或变性；吸附剂由于可逆吸附使含水量变化或减活等， 造成不稳定的柱效。（3）离子交换色谱法离子交换色谱以离子交换树脂为固定相，树脂上具有固定离子基团和可交换的离子基团， 试样中的电离组分与树脂上的可交换离子基团进行可逆交换，根据电离组分对树脂上的固定 离子基团的亲合力不同而得到分离。离子交换树脂可分为阴离子及阳离子交换树脂。阴离子 交换树脂又分为强碱及弱碱性树脂；阳离子交换树
6、脂又分为强酸及弱酸性树脂。由于强碱或强酸性离子交换树脂比较稳定，因此在高效液相色谱中应用较多，可用于分离测定离子型化 合物，如有机酸、碱、盐类和金属离子混合物等。（4）空间排阻色谱法空间排阻色谱又称分子排阻色谱，凝胶色谱等，它是按照溶质分子大小顺序分离混合组 分的。所用的固定相是化学惰性多孔物质，被分离的混合物随流动相通过固定相时，分子大 的组分不发生渗透作用，沿凝胶颗粒间隙流动，流程短，流速快；而分子小的的组分则渗入 凝胶颗粒的孔隙中，流程长，流速慢；因此不同大小的分子流出色谱柱的时间不同从而得到 分离。这种色谱可以分离分子量 100 至 8 105的任何类型的化合物，只要能溶于流动相即 可
7、。（四）高效液相色谱仪高效液相色谱仪一般由高压输液系统。进样系统。色谱分离系统、检测器、记录器或数 据处理机等组成。流程为流动相由高压输液泵输送，样品由进样装置送人，流动相将样品带 入色谱柱进行分离，分离后的各组分依次进入检测器，检测器输出的信号经记录器记录或经 数据处理机记录处理。（l）高压输液系统高压输液系统包括储液器、过滤器、梯度洗脱装置和高压泵。储液器用来存放洗脱液， 由不锈钢或玻璃制成。洗脱液在使用之前需除去所溶解的气体，以免在流人检测池时由于压 力降低形成气泡，影响检测器正常工作。常用的脱气方法有超声波脱气、吹氦脱气和减压脱 气。过滤器安装在泵人口和储液器之间用来滤去洗脱液中的固体
8、微粒以防止对泵系统和密封 圈的堵塞和污染。梯度洗脱可分为低压梯度（外梯度）和高压梯度（内梯度）。低压洗脱装 置是在常压下将不同极性的溶剂按预先设定的比例在泵前混合后，再由高压泵输人色谱柱， 仅需一台泵，重复性好，精密度高；高压梯度装置是用两台或三台高压泵分别将两种或三种 不同极性的溶剂输人混合器，经充分混合后输人色谱柱。应用梯度洗脱可提高分离度，改善 色谱峰形，提高分析精度。高压泵是高效液相仪器中最重要的部件之一，泵的性能好坏直接 影响整个仪器和分析结果的可靠性。对泵的性能应有以下要求：输出压力高：为完成高效 快速分离，希望泵能提供 150300kg/cm2的压力，最高输出压力应为 500kg
9、/cm2左右；流 量范围广：对于分析型仪器，输出流量一般在 0110mL/min 范围内连续可调；流量稳 定：泵的输出流量恒定，无脉冲，流量精度和重复性为 05左右，以使对液体流速敏感 的检测器能稳定地工作，使色谱定性、定量分析具有良好的重现性；耐腐蚀：要适用于各 种有机溶剂、水和缓冲溶液；其它：密封性能好，泵室体积小，便于清洗，便于实现梯度 洗脱功能，能连续不断供液，维修简便等。目前，应用于高效液相色谱仪中的高压泵有恒流 泵和恒压泵两类。恒流泵可提供无脉冲、流量恒定的流动相，如果色谱柱阻力和流动相粘度 等外界条件有变化，只引起柱压变化，流量保持不变。注射式螺杆泵、往复式柱塞泵与往复 式隔膜泵
10、均属此类。恒压泵可提供无脉冲、压力不变的流动相，而流量随外界阻力变化而改 变。如果系统的阻力不发生变化，恒压泵就能提供恒定的流量，气动放大泵属于此类。（2）进样系统进样系统是将待测样送入色谱柱的装置。对于进样装置般要求密封住好、死体积小、 重现性好，保证中心进样，进样时对色谱系统的的压力和流量波动小，并便于实现自动化。 高效液相色谱仪常用的进样装置主要有注射器进样装置和阀进样装置两类。注射器进样： 这种进样装置同气相色谱的进样相似，即将微量注射器的针尖穿过进样口的弹性隔膜，将样 品压人柱头。这种方法获得的柱效比其它任何进样方式都高，但仅适用于 100kg/cm2以下的 低压系统，进样重复性差，
11、隔膜被针刺过的部分容易泄漏。在向较高压力的分离系统进样时， 可采取停流进样，即先停止高压输液，用注射器在常压下进样，然后再恢复系统压力。由于 液体扩散系数小、，停流进样的柱效与常压进样不相上下。只是停流进样无法取得精确的保 留时间，峰形的重现性也不好；阀进样：这种进样装置通常为带有定量管的六通进样阀， 优点是可在高压下进样而无需停流，进样量可变范围大，进样由固定体积的定量管或微量注射器控制，重复性好，易于自动化。缺点是阀的死体积大，容易引起色谱峰展宽，柱效较注 射器进样下降约 10。（3）色谱分离系统高效液相色谱仪最基本的任务是从事分离，所以分离系统是核心。这个系统包括固定相、 流动相和色谱柱
12、，色谱的分离效率和分离能力取决于这三者的精心设计和配合。第一，固定相又称柱填料，它的特性决定色谱柱的性能。填料的热力学性质影响色谱柱 的选择性，决定色谱柱是否适合于所给定的分离。填料的动力学性质或填料的结构特点，如 颗粒的大小、形状、均匀性、表面积、孔径、孔体积等，影响色谱柱的效率。高效液相色谱 的发展，主要是由于柱填料的发展而发展起来的。与经典液相色谱相比，高效液相色谱采用 的固定相的粒度减小（510m），粒度分布均匀（RSD5），有利于传质过程和扩散过 程的加速，从而大大提高了柱效。常用的填料有表面多孔型（薄壳型）和全多孔微粒型。表 面多孔型填料是在一个惰性的硬核（如实心的玻璃球）表面包覆
13、一层很薄的多孔物质，如硅 胶、氧化铝、聚酰胺、离子交换树脂等，也可制成化学健合填料。一般为规则的球形，机械 强度较好，能承受高压，柱填充比较均匀、紧密，渗透性好，传质速度快。由于该填料比表 面积小，容量低，所以进样量要小，要求检测器应很灵敏。全多孔微粒型填料有球形和无定 形两种，有较大的比表面积和孔体积，所以柱容量比较大，检测灵敏度较高。由于填料粒径 小，微孔深度小，固定相的质量传递和滞流流动相的质量传递大大改善，柱效提高，但柱的 渗透性不如表面多孔型填料。第二，流动相在气相色谱中，只是运载样品组分通过色谱柱后进人检测器，而对色谱分 离几乎没有影响，故气相色谱主要通过改变固定相和柱温来改善分离
14、效果；而液相色谱的流 动相，除了运载样品组分通过色谱柱和进人检测器外，还参与和影响色谱分离过程，有时甚 至起主要作用，所以在液相色谱中可通过改变固定相和流动相组成两者来改善分离效果。一 般情况下，选择流动相要考虑以下方面：能溶解样品，但不与样品发生化学反应；与固 定液不互溶，不发生不可逆作用，不引起柱效能和保留特性的变化，不妨碍柱的稳定性； 粘度要小，以避免样品中各组分在流动相中扩散及传质速度下降，降低柱效能，增大柱压。 但粘度太小，在流路中会形成气泡，增加仪器的噪声；应与所用的检测器相适应，用紫外 检测器时，流动相应在所使用的波长下没有吸收或吸收很小；用荧光检测器时，溶剂中不能 含有发生荧光
15、的物质；用示差折光检测器时，选用的溶剂应与待测组分的折光率有较大的差 别，以提高灵敏度；要保证一定的纯度，以免杂质在柱中累积影响柱效能，增加噪声。完 全符合以上要求的溶剂是没有的，实际工作中溶剂选择的主要依据还是相对极性大小，兼顾 其它物理化学性质。另外，高效液相色谱所用的流动相，均需经过纯化、脱气等处理，以保 证柱和检测器性能良好及延长它们的使用寿命。高效液相色谱柱按几何特性可分为常规柱、快速柱和微量色谱柱，后者又分为细管径柱、 填充毛细管柱和开管柱。近年来，快速柱和微量色谱柱的开发已逐渐引起人们重视。由于柱 填充技术的完善和 3m 填料的出现，快速柱仅用 35cm 的柱长，就能获得 400
16、05000 个 理论塔板数，能显著地缩短分析时间和节省大量溶剂。细管径色谱柱由于分辨率高、检测灵 敏度高、溶剂消耗少及便于联用技术的实现，具有美好的应用前景。第三，色谱柱一般采用优质不锈钢制成，内壁经精细抛光处理以避免管壁效应。微量色 谱柱可采用弹性石英管或聚四氟乙烯材料制作。色谱柱的长度根据填料颗粒的大小来确定， 对于常用的 510m 填料，柱长一般为 1030cm，多数商品预装柱为 25cm，凝胶柱比较长。 加大柱长将延长分析时间，增加柱压，所以，在分离度符合要求的情况下，应尽量使用短柱。 使用短柱，柱外峰扩展成为影响柱效的重要因素，因此，常规分析柱的柱长不要小于 10cm。柱内径明显地影响柱效，这主要是因为柱内的分子径向扩散和管壁效应引起的。如果 柱内径不够大，则分子在流出柱子之前将扩散到管壁区，管壁区的填充不如柱中心区均匀， 流动相流速将会改变，使峰展宽。一般用于分析的色谱柱，内径为 25mm。随着柱填充技 术的发展，内径为 2mm 的色谱柱逐渐受到重视，因为在相同的分析时间
