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1、研究生学位论文大型海藻孔石莼对赤潮微藻克生 作用的实验研究及其克生物质的 分离与鉴定_ R # 自盒敢* _ t 雌$ 董双林教摄壬长云截授十* m _ ! ! 一n $ -* 女* _ 日_ i 螋! ! 墨垫! ￥n 普f 日_ ! 唑! 曼中国海洋大学大型海藻孔石莼对赤潮微藻克生作用的实验研究及其克生物质的分离与鉴定一摘要大型海藻孔石莼对赤潮微藻克生作用的实验研究及其克生物质的分离与鉴定摘要随着沿海水域富营养化的加剧，“赤潮”( 海洋有害微藻藻华) 在世界范围内的沿海水域频繁发生，已成为一种严重的世界性海洋灾害。我国由赤潮引起的直接经济损失每年达1 0 亿元以上。如何科学、有效地进行赤潮
2、的治理和控制，已成为迫切需要解决的世界性重大问题；寻找方便有效、低投入、对环境相对无害的赤潮防治方法为目前所急需。迄今为止，国内外学者探索了许多方法预防和控制赤潮，包括物理法( 絮凝法，如粘土) 、化学法( 药剂法，如硫酸铜) 、生物防治法( 微生物，如细菌、病毒) 等，但在实际中大规模应用的尚很少，有些方法对近海生态系统会产生破坏作用。另一方面，沿海水域的富营养化也导致了“绿潮”( 海洋大型绿藻藻华) 问题日益突出。大量象孔石莼、缘管浒苔等的大型绿藻在沿海漂浮和堆积，给沿海渔业、养殖业和旅游业造成重大损失。如何有效地利用这些绿藻资源，减少绿潮带来的经济损失也是急待解决的课题。对于赤潮，生物防
3、治是其治理的发展趋势。生物防治对环境的影响相对较小，甚至具有保护作用。这一防治策略对海洋生态环境良性循环的建立与维护，以及对海洋经济的可持续性发展，具有重要的现实意义。目前，有关赤潮的研究中，海洋化学生态学已经成为新兴的国际前沿研究领域。相生相克是水域生态系统中普遍存在的自然现象，包括各种生物之间的生长促进和抑制作用。本文研究了大型绿藻孔石莼对几种赤潮微藻的克生作用，并初步分离和鉴定了其抑制赤潮微藻生长的克生物质，探讨了孔石莼对赤潮微藻克生作用的化学物质本质，为利用绿潮生物来治理赤潮生物提供科学依据。主要实验结果如下：1 两种不同品系的孔石莼对赤潮异弯藻和亚历山大藻的克生效应利用长期共存培养系
4、统研究了不同初始浓度无性系和有性系孔石莼( U l v ap e r t u s a ) 新鲜组织和干粉末对赤潮异弯藻( H e t e r o s i g m aa k a s h i w o ) 和亚历山大大型海藻孔石莼对赤潮微藻克生作用的实验研究及其克生物质的分离与鉴定一摘要藻( A l e x a n d r i u mt a m a r e n s e ) 生跃的克生作用，并检验了大藻培养水过滤液对这两种赤潮微藻的作用。建立了分隔共培养系统以排除大藻对两种赤潮微藻生长的直接接触抑制作用，证明了克生物质的存在。研究了两系孔石莼对赤潮异弯藻的短期杀藻作用并得出了赤潮异弯藻在两系孔石莼作用
5、下的细胞溶解率。共存实验结果表明，两系孔石莼的新鲜组织和干粉末对赤潮异弯藻和亚历山大藻的生长均有强烈的抑制作用，在较高浓度下还能完全杀死赤潮异弯藻细胞。而两种微藻在一次性和半连续大藻培养水过滤液添加方式下生长都没有受到明显抑制，表明两系孔石莼所分泌的克生物质容易降解；在干、鲜重相当时，两系孔石莼新鲜组织比其干粉末更能有效地抑制两种微藻的生长，表明大藻新鲜组织内克生物质的连续分泌是有效抑制两种赤潮微藻生长的关键。2 子L 石莼和缘管浒苔对海洋原甲藻生长的克制作用利用共存培养系统研究了不同初始浓度的两种能形成藻华的大型绿藻孔石莼( U l v ap e r t u s a ) 和缘管浒苔( U l
6、 v al i n z a ) 新鲜组织和干粉末对赤潮微藻海洋原甲藻( P r o r o c e n t r u mm i c a n s ) 生长的克生作用，并检验了大藻培养水过滤液对这种赤潮藻的作用。另外还研究了海洋原甲藻对这两种大型绿藻生长的作用。初步研究了这两种大型绿藻的蒸馏水及四种有机溶剂( 甲醇、丙酮、乙醚和氯仿)抽提物对海洋原甲藻的杀藻作用，以证实这两种大型绿藻组织中有克生物质存在。共存实验结果表明，两种大型绿藻的新鲜组织和干粉末对海洋原甲藻的生长均有强烈的抑制作用，并且在较高浓度的大藻作用下，海洋原甲藻完全死亡。海洋原甲藻在一次性大藻培养水过滤液添加方式下生长没有受到明显抑制
7、，而在半连续添加方式下，其生长受到了显著抑制。表明这两种大型绿藻所分泌的克生物质容易降解；并且其新鲜组织内微量克生物质的连续分泌是有效克制海洋原甲藻生长的关键。相反，海洋原甲藻对这两种大型绿藻的生长没有明显的作用。这两种大型绿藻的蒸馏水与甲醇抽提物对海洋原甲藻的生长有强烈的抑制作用，而其他三种极性较低的有机溶剂抽提物对海洋原甲藻的生长没有明显的作用，表明这两种大型绿藻组织内所含有的克生物质具有较高的极性。3 无性系孔石莼组织提取物对三种赤潮藻的生长抑制作用大型海藻孔石莼对赤潮微藻克生作用的实验研究及其克生物质的分离与鉴定一摘要研究了不同浓度的无性系孔石莼( U l v ap e r t u s
8、 a ) 组织蒸馏水及4 种具有不同极性的有机溶剂( 极性从高到低：甲醇 丙酮 乙醚 氯仿) 提取物对三种典型的赤潮藻：赤潮异弯藻( H e t e r o s i g m aa k a s h i w o ) 、亚历山大藻( A l e x a n d r i u mt a m a r e n s e ) 和海洋原甲藻( P r o r o c e n t r u m m i c a n s ) 的生长抑制作用。孔石莼组织甲醇提取物在5 种提取物中具有最高的生长抑制活性。在相对较高浓度的此种提取物作用下，三种赤潮藻均完全死亡。较高浓度的孔石莼组织蒸馏水提取物对三种赤潮藻的生长均有显著的抑制作
9、用，但是在最高的浓度下也不能使三种赤潮藻完全死亡。另外3 种有机溶剂的提取物对三种赤潮藻的生长没有明显的影响。结果表明，孔石莼组织中确实含有对三种赤潮藻的生长有抑制作用的活性物质，且这些物质具有相对较高的极性。三种赤潮藻对孔石莼组织提取物的敏感程度也不同，赤潮异弯藻最敏感，海洋原甲藻次之，亚历山大藻最不敏感。4 子L 石莼组织内克生物质的提取、分离与鉴定将3 8 5k g 的孔石莼( U l v a p e r t u s a ) 干粉末用甲醇抽提得到3 2 0g 耦提物浸膏，然后将浸膏萃取分离为石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和蒸馏水相。对这4 个相进行了高效液相色谱( H P L C ) 分
10、析，然后对石油醚相和乙酸乙酯相进行了气相色谱一质谱( G C M S ) 联用分析。并且用赤潮异弯藻( H e t e r o s i g m aa k a s h i w o ) 进行各个分离组分的克生活性检测。活性检测表明石油醚相和乙酸乙酯相具有很强的杀藻活性，G C M S 分析鉴定其中的1 6 种脂肪酸，其中不饱和脂肪酸占大部分。纯化合物活性检测表明9 ，1 2 ，1 5 一十八碳三烯酸、6 ，9 ，1 2 ，1 5 - 十八碳四烯酸、5 z ，8 Z ，1I Z ，1 4 Z 一二十碳四烯酸、5 Z ，11 Z ，1 4 Z ，1 7 Z 一二十碳四烯酸和5 z 8 z 11 Z 1
11、 4 Z ，1 7 z 一二十碳五烯酸具有很强的杀藻活性，其有效浓度在5m gl 。以下。实验结果表明，孔石莼组织中含有多种不饱和脂肪酸，其中一些对赤潮异弯藻具有强烈的杀藻作用，表明不饱和脂肪酸可能是孔石莼组织内抑制赤潮微藻生长的克生物质的重要组成成分之一。5 非营养环境因子对孔石莼克制赤潮异弯藻效果和两者生长的影响研究了不同水平的温度( 1 0 、1 5 、2 5 和3 0 。C ) 、盐度( 1 0 、2 0 、3 0 和4 0p p t ) 、光照( 2 0 、1 0 0 、2 0 0 和4 0 0g m o l m - 2s 。) 和p H 值( 5 5 、7 、8 , 5 和1 0
12、) 这四个大型海藻孔石莼对赤潮微藻克生作用的实验研究及其克生物质的分离，捧定一摘要非营养环境因子两两因子处理组合对大型海洋绿藻孑L 石莼( U l v a p e r t u s a ) 和海洋赤潮微藻赤潮异弯藻( H e t e r o s i g m aa k a s h i w o ) 生长和孔石莼克制赤潮异弯藻效果的影响，得出了孔石莼和赤潮异弯藻平均生长率及大藻克制微藻生长抑制率与以上四个因子两两之间的非线性回归方程。温度、盐度、光照和p H 值两两因子组合对孔石莼和赤潮异弯藻的平均生长率及大藻克制微藻生长抑制率均有显著的影响( p O 0 5 ) 的或只有轻微的抑制作用。相反，在浓度
13、为0 6g - d r yl 。1 时，与对照相比有性系孔石莼干粉末在6 天以后显著( p O 0 5 ) 进了赤潮异弯藻的生长。高浓度( 1 2 ，2 4g - d r yl 。) 时，在有性系孔石莼干粉末的作用下全部的赤潮异弯藻细胞在2 天内死亡( 图2 4 B ) 。 装V出 划 斗 O 0 5 ) 的抑制作用( 图2 - - 4D ) 。虽然在最高粉末浓度时，亚历山大藻的生物量很低，但是两系孔石莼干粉末对亚历山大藻没有完全致死作用。4 天后，亚历山大藻的生长也开始逐渐恢复( 图2 4 c ，D ) 。两种不同品系的孔石莼对赤潮异弯藻和亚历山大藻克生效麻的对比研究无性系孔石莼干粉末对赤潮
14、异弯藻和亚历山大藻生长的抑制作用要比有性系的强( 图2 - - 5 A ，B ) 。无性系孔石莼干粉术对赤潮异弯藻和亚历山大藻的E c 5 。浓度分别为0 4 和0 6g - w e t1 一，而有性系孔石莼干粉末相应的E C 5 0 浓度分别为1 0 和O 8g - w e t l 1 ( 表2 1 ) 。AB8 0f护1 烈。 羲一琴一 CD：雾一：雾一 时间( 天)图2 4 与不同初始接种浓度( o0 ；0 1 5 ；o 3 ；O 6 ；1 2 ；口2 4g - d r yl - 1 ) 的无性系( A C ) 和有性系( B ，D ) 孔石莼干粉末长期共存时的赤潮 异弯藻( A ，B
15、) 和亚历山大藻( C ，D ) 生跃曲线。数据表示平均值( n = 3 ) 。F i g 2 - - 4 G r o w t hc a r v e so fHa k a s h i w o ( A ，B ) o rAt a m a r e n s e ( C ，D ) c o e x i s t i n gw i t hd i f f e r e n ti n i t i a li n o c u l a t i o nc o n c e n t r a t i o n s ( oO ；0 1 5 ：0 3 ；0 6 ；1 2 ；口2 4g - d r yno fd r yp o w d e
16、 ro ft h en o n s e x u a l ( A ，c ) o rt h es e x u a l ( B ，D )s t r a i no f 矿p e r t u s ai nl o n g - t e r mc o e x i s t e n c ea s s a y sD a t ar e p r e s e n ta v e r a g ev a l u e s( n = 3 ) 4 7I-一目一一8毛I一删器州两种不同品系的孔石莼对赤湖异弯藻和砸历山大藻克生效应的对比研究表2 1 用E c 5 0 值表示的两系孔石莼新鲜组织和干粉末对赤潮异弯藻和亚历山人藻的生长抑制作用。T 曲I e2 1 S u m m a r yo f i n h i b i t o r ye f f e c t so f t h e f r e s h t i s s u e ( g w e t i - 1 ) o r t h ed
