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1、微生物学通报 JUN 20, 2009, 36(6): 865869 Microbiology 2009 by Institute of Microbiology, CAS 基金项目：安徽省教育厅自然科学基金项目(No. KJ2008B058) * 通讯作者：Tel: 86-558-2596148; : miao- 收稿日期：2008-10-26; 接受日期：2009-02-23 研究报告四种植物内生真菌的分离及其抗肿瘤活性的筛选 缪 莉* 王元元 朱 磊 吴正军 周如梅 (阜阳师范学院生命科学学院 安徽 阜阳 236041) 摘 要: 从银杏、合欢、臭椿和苦楝的树皮中分离到 61 株内生真
2、菌。MTT法检测显示在 45.9%的菌株发酵液粗提物在 200 g/mL时对人食道癌细胞EC109 的生长抑制率大于 50%。其中 6 株内生真菌(YX5, YX17, YX36, KL1, CC1, CC5)在 50 g/mL时仍具有较高的细胞毒活性, 且活性成分主要分布在菌株的发酵液中。合欢内生真菌中的活性菌株比例最小, 在 50 g/mL时均未显示任何对EC109 细胞的抑制作用。银杏中的高活性菌株比例最大, 占银杏内生真菌的 15.8%。银杏分离菌株YX5 的活性最为突出, 其发酵液粗提物对 3 种肿瘤细胞EC109, HONE1 和HeLa的抑制率IC50分别是 18.3 g/mL、
3、3.6 g/mL和 6.5 g/mL。研究结果表明, 作为抗肿瘤药物的潜在来源银杏内生真菌值得关注。 关键词: 植物内生真菌, 抗肿瘤活性, 筛选, 银杏 Endophytic Fungi from Four Plant Species: Their Isolation and Antitumor Activity MIAO Li* WANG Yuan-Yuan ZHU Lei WU Zheng-Jun ZHOU Ru-Mei (School of Life Science, Fuyang Teachers College, Fuyang, Anhui 236041, China) Abstr
4、act: We isolated 61 endophyte isolates from the bark of 4 plants, Ginkgo biloba L, Albizzia julibrissin Durazz, Ailanthus sltissima (Mill) Swingle and Melia azedarach L. At the test concentration of 200 g/mL, higher than 50% of antitumor activities were demonstrated with crude extracts from 45.9% of
5、 fungal culture in MTT assay. Six isolates, YX5, YX17, YX36, KL1, CC1 and CC5, still showed higher cytotoxicity at 50 g/mL. No isolates from A. julibrissin had inhibitory effect towards EC109 at the test concentration of 50 g/mL; while about 15.8% of isolates from G. biloba were active. IC50 of the
6、extract from the most active isolate YX5 against EC109, HONE1 and HeLa were 18.3 g/mL, 3.6 g/mL and 6.5 g/mL, respectively. Our results indicate that endophytes from G. biloba could be regarded as a potent source of antitumor drugs. Keywords: Endophytic fungi, Antitumor activity, Screening, Ginkgo b
7、iloba植物内生真菌(Endophytic fungi)能产生许多具有各种生物活性的物质。自从 1993 年Stierie等1报道从短叶红豆杉(Taxus brevifolia)的韧皮部分离到的内生真菌Taxomyces andreanae可产生与宿主相同的抗肿瘤代谢产物紫杉醇以来, 国内外的研究者已经从植物内生真菌中已分离到许多具有抗肿瘤活性的天然产物2,3, 由于真菌来源广泛, 可以通过发酵生产或通过改进和控制发酵工艺及菌种选育等途径提866 微生物学通报 2009, Vol.36, No.6 http:/ 高所需化合物的含量, 且不存在大量破坏生物资源等问题。因此, 从真菌中研究开发高
8、效低毒且资源充分的抗肿瘤药物具有良好的前景4。 银杏(Ginkgo biloba L)、合欢(Albizzia julibrissin Durazz)、臭椿(Ailanthus sltissima Swingle)、苦楝(Melia azedarach L)均有一定的药用价值。银杏富含黄酮类物质, 具有防治心脑血管疾病、抗肿瘤、抗病毒、消炎、抗血小板活化因子、延缓衰老和美容等治疗和保健作用5,6。合欢皮具解郁安神、活血消肿之效。臭椿的树皮, 具有清热、消炎、燥湿、止血、杀虫等功效7。臭椿根皮提取物具有抗阿米巴原虫活性, 也可作为除虫剂; 并有明显的抗肿瘤作用, 可用于治疗宫颈癌、结肠癌、直肠癌
9、等8。苦楝皮中含有苦楝素, 具有较强的杀虫作用, 可治多种肠道寄生虫, 为广谱驱虫中药9。在这 4 种植物中, 合欢、臭椿内生真菌的研究尚未见报道, 而对银杏、苦楝内生真菌仅有少量的研究报道10。其中关于银杏内生真菌的研究主要集中在分离鉴定及其抗菌活性。如郭建新等11报道从银杏根、茎、叶和果实中分离到的约 60%的内生真菌中对 7 种植物病原真菌具有抑菌活性。但对于银杏内生真菌抗肿瘤活性的研究却很少。 鉴于这 4 种植物均具有良好的杀虫消炎抗肿瘤功效, 相信它们的内生真菌也具有产生与其宿主相同或相似的活性物质, 因此本文对银杏、合欢、臭椿、苦楝树皮中的内生真菌进行分离, 并对其抗肿瘤活性进行筛
10、选, 为进一步分离高效低毒的抗肿瘤活性物质提供研究基础。 1 材料与方法材料与方法 1.1 材料 分离材料: 银杏、臭椿、合欢、苦楝采自阜阳师范学院校园, 取材部位为距地 1.5 m 左右的主干树皮, 厚度约 3 mm8 mm, 银杏树龄 3040 年, 树干直径 50 cm60 cm; 臭椿树龄 810 年, 树干直径10 cm15 cm; 合欢树龄 1520 年, 树干直径 30 cm 40 cm; 苦楝树龄 1015 年, 树干直径 30 cm40 cm。 肿瘤细胞: 人食道癌 EC109 细胞系来自于中南民族大学发酵与酶工程研究室, 人宫颈癌 HeLa细胞系和人鼻咽癌 HONE1 细胞
11、系来自于香港科技大学癌症研究中心。 1.2 方法 1.2.1 内生真菌的分离纯化与鉴定: 采用组织块 法12, 对 4 种药用植物树皮中内生真菌进行分离。取采集的新鲜银杏、臭椿、合欢和苦楝树皮, 用蒸馏水将新鲜植物表面洗净, 稍干后去外表皮, 取其韧皮部或木质部内切成适宜长度的小段, 在 75%乙醇中浸泡 5 min, 再用无菌水冲洗 34 次, 无菌滤纸吸干。再将其切成 5 mm5 mm的小块贴放于含 100 g/mL青霉素和链霉素的PDA培养基上, 每皿 4 块, 每种树皮样品做 10 块平皿。置 25C恒温培养箱中培养 3 d20 d, 待培养基上各植物组织周围长出菌丝后, 采用尖端菌丝
12、挑取法转移至新的PDA培养基平板上, 并置于 25C恒温培养箱中继续培养。待挑取的菌丝长成直径 3 cm左右的菌落后, 根据各菌落颜色、形态判断是否为纯菌。若长出的菌落不是纯菌, 可再次采用尖端菌丝挑取法转移至新的PDA培养基上进行纯化。纯化后的菌株于 10%的无菌甘油管内80C保存。 鉴定: 对具有高肿瘤活性的菌株, 根据其菌落的平皿培养特征, 并利用光学显微镜观察产孢结构和孢子形态等特征, 参考Saccardo分类系统13鉴定菌株的分类单元。 1.2.2 内生真菌的液体发酵培养及后处理: 将菌丝块接种于装有 50 mL PDB 培养基的 250 mL 的三角瓶中, 25C、120 r/mi
13、n 摇床培养 7 d。发酵液经 68层纱布过滤后除菌丝体, 滤液用等体积乙酸乙酯萃取 2 次, 合并有机相, 35C 真空浓缩后, 将残余物溶于 DMSO 中, 配成浓度为 50 g/L 的溶液, 即为发酵液粗提物。过滤得到的菌丝体经冷冻干燥后, 用适量甲醇萃取 2 次, 合并甲醇相, 真空浓缩后, 残余物溶于 DMSO 中, 即为菌体粗提物。 1.2.3 肿瘤细胞的培养与内生真菌抗肿瘤活性的测 定: 采用人食道癌EC109 细胞系, 人宫颈癌HeLa细胞系和人鼻咽癌HONE1细胞系, 用含 10%新生牛血清的RPMI1640 完全培养基, 在 37C通入 5% CO2的细胞培养箱中培养传代。
14、采用体外细胞毒测定的MTT法测定菌体粗提物或发酵液粗提物的抗肿瘤活性。取对数生长期的肿瘤细胞。用胰蛋白酶消化后, 用完全培养基制成细胞悬浮液, 血球计数板计数, 随后取 80 L接种于 96 孔板, 按每孔 50008000 个细胞接种, 留两孔做空白对照。置于 5% CO2, 37C培养箱中培养 1 d后, 加入 20 L经完全培养液稀释缪 莉等: 四种植物内生真菌的分离及其抗肿瘤活性的筛选 867 http:/ 的样品(阴性对照组加 20 L培养液, 空白组加入1 0 0 L 的 培 养 液 , 每 个 样 品 做3个 重 复), 继续培养 2 d 后取出, 吸弃培养基, 每孔加入2.5
15、g/L 的 MTT 溶液 20 L, 37C 反应 4 h 后, 每孔再加 100 L DMSO, 37C 溶解 30 min; 用酶标仪测量各孔吸光值(测量波长为 570 nm)。按下式计算抑制率: 阴性对照 OD 值实验组 OD 值 抑制率= 阴性对照OD值空白对照OD值100%2 结果与分析结果与分析 2.1 内生真菌的分离 从 4 种药用植物银杏、合欢、臭椿和苦楝的树皮中共分离到内生真菌 61 株。其中银杏、苦楝、臭椿中分离到的内生真菌数量较多, 占总数的 30%左右, 合欢中分离到的菌株数量则很少(表 1)。在分离过程中发现, 不同植物中内生真菌生长快慢不一。苦楝树皮中内生真菌生长最快, 接种后 25C 培养 2 d就已经有菌落长出; 随后, 臭椿树皮样品中的内生真菌开始生长, 且菌落生长速度较快; 银杏和合欢中内生真菌菌落出现最晚, 接种培养 6 d 以后自组织块边缘才开始有菌丝的生长, 且生长较为缓慢。从不同树种中分离到的许多真菌在菌落形态、颜色和菌丝生长速度等方面差异较为显著, 表明内生真菌具有
