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1、At h e s i ss u b m i t t e dt oZ h e n g z h o uU n i v e r s i t yf o rt h ed e g r e eo fM a s t e rE f f e c to fC e l e c o x i bo np e r i t o n e a lf u n c t i o na n da n g i o g e n e s i si nu r e m i cp e r i t o n e a ld i a l y s i sr a t sT h eF i r s原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立
2、进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。学位论文作者：易暑讧日期锄，产、J 厂月钥学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用
3、学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文作者。名忍钞日厂步r 月7 口日摘要塞来昔布对尿毒症腹膜透析大鼠腹膜功能和血管 新生的影响研究生：赵志红导师：赵占正郑州大学第一附属医院肾脏内科河南郑州4 5 0 0 5 2摘要终末期肾脏病( e n d s t a g er e n a ld i s e a s e ，E S R D ) 已成为2 1 世纪严重影响人类健康的一种疾病之一，且发病率呈逐年上升趋势。目前，E S R D 的主要肾脏替代治疗方法有血液透析( h e m o d i a l y s i s ，H D )
4、 、腹膜透析( p e r i t o n e a ld i a l y s i s ，P D ) 及肾移植，鉴于肾移植肾脏来源的有限，P D 较H D 具有操作方便、不需要依赖特殊设备、费用较低、交叉感染率较低、更好的保护残余肾功能、对血流动力学影响较小等优点，逐渐成为E S R D 患者主要的肾脏替代治疗方式之一，越来越被尿毒症患者所接受。但长期P D 易出现腹膜炎、腹膜功能及形态结构的改变及营养不良等因素，易引起超滤衰( u l t r a f i l t r a t i o nf a i l u r e ，U F F ) 。有研究证实，4 5 年U F F 的发生率高达3 6 ，成为P
5、 D 患者被迫退出P D 的主要原因。U F F 的主要机制主要包括腹膜血管新生、腹膜纤维化以及腹膜间质淋巴系统吸收增加。腹膜新生血管的形成逐渐成为研究热点，因此，积极研究与P D 相关的腹膜新生血管形成的发生机制和治疗方法对延长P D 患者的腹透时间及提高其生存率具有及其重要的意义。血管内皮生长因子( v a s c u l a re n d o t h e l i a lg r o w t hf a c t o r , V E G F ) ，是目前已知的最强有力的促血管形成因子，可以诱导血管新生。在长期人P D 患者及动物模型中均已证实V E G F 水平明显升高，V E G F 的产生及
6、其所具有的生物学效应使腹膜组织中新生血管的生成增多，V E G F 的表达与腹膜净超滤量呈显著负相关。环氧化酶( c y c l o o x y g e n a s e ，C O X ) 是前列腺素合成过程中的限速酶，有摘要C O X - l 、C O X - 2 和C O X - 3 三种，目前研究最多的是C O X - 2 ，C O X - 2 在静息状态下很少表达或不表达，但在其受到细胞因子、生长因子及肿瘤刺激因子等刺激后其表达明显升高，目前已研究证实C O X - 2 参与多种肿瘤血管的生成。高表达的C O X 2 通过花生四烯酸产物前列腺素、血栓素刺激V E G F 的形成，也可直接
7、上调V E G F 的表达水平，增加血管通透性及已形成血管的血流量，抑制内皮细胞凋亡，直接或间接促进血管生成。V E G F 进一步诱导花生四烯酸产生前列腺素和上调C O X 2 的表达。已有学者证实在多种肿瘤组织中C O X - 2 、V E G F表达与微血管的形成具有正相关性，用C O X 2 选择性抑制剂可抑制P G E 2 、P G l 2及V E G Fm R N A 及蛋白水平的表达。因此联想到研究尿毒症腹膜透析大鼠腹膜组织中V E G F 和C O X 2 的表达及二者相关性，应用C O X - 2 抑制剂( 塞来昔布)观察C O X 2 、V E G F 的表达及腹膜功能的变
8、化，探讨其对新生血管形成中的相互作用及其机制，为临床防治血管新生及U F F 发生机制提供新的方向和理论依据。方法选取清洁级健康S D 大鼠4 8 只，体质量在1 8 0 - 2 0 0 9 。行大鼠5 6 肾脏切除术，构建尿毒症模型，并在此基础上建立腹膜透析模型。实验组别分为：A ：正常组( n - - g ) ，B ：假手术组( n = 8 ) ，C ：尿毒症非腹透组( n = 8 ) ，D ：4 2 5 腹透组( D 1 ：2 周模型组( n - 8 ) ，D 2 ：4 周模型组( n - 8 ) ) ，E ：塞来昔布干预组( n = 8 ) ：塞来昔布每日2 0 m g 瓜gB W 干
9、预4 周。A 组不进行任何处理；B 组行双侧肾包膜剔除术；D 、E 组按照按3 m l 1 0 0 9B W 从大鼠颈部腹透管注入4 2 5 腹透液，规律对其进行腹膜透析；E 组在规律腹透期间，每日每只塞来昔布灌胃2 0 m g k gB W ，连续4 周。D l 组于2 周杀检大鼠，其余各组均4 周杀检大鼠。D 1 、D 2 、E 组处死前行腹膜平衡实验( p e r i t o n e a le q u i l i b r a t i o nt e s t ，P E T ) 。计算葡萄糖转运量和超滤量反应腹膜功能；留取壁层和大网膜，壁层腹膜行H E 和M a s s o n 染色观察腹膜病
10、理变化；大网膜行免疫组化观察腹膜中C O X 2 、V E G F 蛋白表达变化，C D 3 1 染色观察腹膜组织毛细血管密度( M i c r o v e s s dD e n s i t y , M V D ) ；逆转录聚合酶链反应( R T - P C R ) 检测腹膜中C O X 2 和V E G Fm R N A 表达水平变化。对上述数据进行统计学分析，以P 0 0 5 ) ，尿毒症非腹透组、4 2 5 腹透组V E G F 和C O X 2m R N A 、蛋白表达均明显升高，其差异有明显统计学意义( 均P 0 0 5 ) ，尿毒症非腹透组及4 2 5 腹透组M V D 值明显升高
11、，其差异有明显统计学意义( 均P 延伸J2 材料与方法2 4 5P C R 扩增产物分析将已配置好的2 琼脂糖凝胶置入电泳槽中，加入1 0 x T A E 液没过凝胶表面。移液枪吸取3 9 l 扩增产物点样，另取D N AM a r k e r3 t x l 加入凝胶孔中进行电泳，作为目的基因片段大小的参照。电泳条件：电压1 1 0 V ，电泳时间2 0 3 0 m i n 。然后在紫外投射仪下观察条带，拍照后用凝胶成像分析仪分析图像。以目的基因的D N A 条带与内参G A P D H 的D N A 条带的灰度值比值大小作为目的基因m R N A 表达量。2 5 统计学方法使用统计软件S P
12、 S S l 7 0 对数据进行统计学分析。计量资料用均数士标准差( ) 函) 来表示。两样本均数比较用t 检验。多组之间的比较用单因素方差分析。相关性分析用P e a r s o n 相关分析。以a = 0 0 5 为检验水准。1 23 结果3 结果3 1 尿毒症腹膜透析大鼠模型制作结果3 1 15 6 肾切除法尿毒症大鼠模型制作尿毒症大鼠模型制作是否成功判断标准：实验分两步，第一步：首先行左肾2 3 切除。按照双肾重量占体重的0 7 4 估计切除的重量，依此估算，左肾2 3切除理论值为0 4 6 8 7 + 0 0 3 2 9 ，实际值为0 4 6 9 1 + 0 0 2 4 9 ，用两样
13、本均数比较的t检验，二者差异无明显统计意义( P O 0 5 ) ，说明左肾2 3 切除符合要求。左肾2 3 切除时，因肾切除部位止血不当，导致1 只大鼠死亡，原因可能为失血性休克。第二步：右肾全切( 左肾2 3 切除一周后) ，1 只大鼠出现明显腹胀，食量减少，最后死亡，解剖证实其死亡原因为肠梗阻，考虑与手术导致的肠粘连相关。假手术组行双肾包膜剥除术，未出现不良反应。6 周后，检测各组大鼠肾功能( 血清尿素氮和血清肌酐值) 。若大鼠血清肌酐值是正常大鼠血清肌酐值得2 - 3倍，则认为造模成功【1 8 】。实验中有1 只大鼠肌酐水平未达上述标准，3 只大鼠因感染死亡而退出实验。与正常组大鼠相比
14、，假手术组肾功能的变化差异无明显统计意义( P O 0 5 ) ，与正常组相比较，尿毒症组大鼠血清尿素氮和血清肌酐水平则明显升高，差异有显著统计学意义( 尸如0 5 ) 。见表2 ，图l 。表2 正常组、假手术组和尿毒症组大鼠肾功能比较( x 士s )注：与正常组比较，? 舢0 5 ，b P 0 0 5 ，b P O 0 5 ) ；与正常组大鼠相比，尿毒症组大鼠体重则明显下降，差异有显著统计学意义( 尸 O 0 5 ，b P 0 0 5 ) ，尿毒症非腹透组及4 2 5 P D4周组V E G E 、C O X - 2 的平均灰度值明显升高，其差异有明显统计学意义( 均Po 0 5 ，6 p
15、0 0 5 ) ，尿毒症非腹透组及4 , 2 5 P D 4 周组V E G E 、C O X 2 的m R N A 表达明显升高，其差异有明显统计学意义( P o 0 5 ：与正常组及假手术组相比，6 p 7 月的l O例E S R D 患者( 应用高糖透析液) ，腹腔中V E G F 产量较改用无糖腹透液患者( 其中4 例1 明显升高。这都表明V E G F 与葡萄糖透析液有关。国内研究也表明【4 9 H P M C 中V E G F 表达水平在尿毒症及高糖环境下显著高于正常对照组，而且其表达量与葡萄糖浓度成正相关，但是其机制尚不完全明确。一些学者认为真正起作用的是非酶糖化产物【4 5 1
16、 ，而不仅仅是高糖本身，他们将糖化白蛋白和D 葡萄糖注入H P M C 中，结果发现，前者使V E G F 表达明显增加，后者则不能。在动物实验研究腹膜组织中的V E G F 和血管密度的关系中发现咖】，腹膜组织中的V E G F 水平以及腹膜血管密度在高G D P 组腹膜透析液组中均显著高于低G D P组。体内外实验研究均证实G D P s 中的甲基乙二醛( M G O ) 都可以增强V E G F的表达，进而促使腹膜血管生成增多【5 l 】。A G E s 增多的原因主要有：透析液中的高糖加热消毒以及腹膜组织中的蛋白质( 长期暴露于高糖液中) 发生糖基化反应。A G E s 产生增多也能诱导V E G F 在多种细胞类型中表达升高【1 9 5 2 】；腹膜中A G E s 的沉积与V E G F 及血管生成成正性关系；另外，从分子机制角度( 糖尿病视网膜病变机制) 也明确了A G E s 、V E G F 、血管新生三
