《我国小型猪内源性反转录病毒的相关研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《我国小型猪内源性反转录病毒的相关研究（5页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、2 0 1 0 广州一东莞前届国际小型猪学术论坛我国小型猪内源性反转录病毒的相关研究马玉嫒1 ，吕茂民1 ，吴健敏地，颜奇坡1 ，丁芳1 ，田克恭3 ，章金刚1 产( 1 军事医学科学院野战输血研究所北京1 0 0 8 5 0 ：2 广西壮族自治区兽医研究所南宁5 3 0 0 0 1 ；3 农业部兽医诊断中心，北京1 0 0 0 9 4 )随着移植医学和免疫学研究的进展，也由于人源供体器官的短缺，猪被选定为最合适的异种移植供体。现今，猪心脏瓣膜己成功地移植入人体内【1 1 ，猪皮肤已作为烧伤病人的暂时覆盖物，猪胰岛细胞已被植入糖尿病人体内，猪_ 人异种移植已展现出十分诱人的前景。然而，猪内源性
2、反转录病毒( P o r c i n ee n d o g e n o u sr e t r o v i r u s ，P E R V ) 在体外能够感染多种人源细胞的发现【2 】，引起了人们对异种移植病原安全性的广泛关注，人们担心带有P E R V 的猪的细胞或器 官一旦植入高度免疫抑制的人体内会否突破种问屏障造成人源大流铲3 , 4 】。因此，猪内源性病毒的研究与检测是猪。人异种器官移植、人用猪源生物制品等生物安全性的基础，也是进行高等级医学实验的前提。我国有着异常丰富的猪种资源，特有小型猪种更是适合医学实验研究和人类异种移植的首选供 体，我困已经启动和丌展了小型猪资源开发利用、异种移植的
3、基础研究等项目。本文仅就我们近年 来有关P E R V 的研究情况做以简要总结，供参考。1 、P E R V 核酸检测方法的建立以4 株猪源细胞为模型，建立了检测P E R V 整合存在和分型检测的P C R 技术以及P E R V 表达的R T - P C R 技术，并对其特异性、敏感性、重复性等进行了研究。建立了检测猪基冈组中整合的P E R V 拷贝数的基于S Y B RG r e e nI 染料的荧光定量P C R 技术，并对其特异性、敏感性、重复性进行了研究。2 、中国特有小型猪内源性反转录病毒存在状况的调查在全国范同内首次大规模开展了我国小型猪中内源性反转录病毒存在状况的调查，系统
4、检测分析P E R V 在我国小型猪中存在与表达情况。以4 株猪源细胞为模型，建立了检测P E R V 整合存在和分型检测的P C R 技术以及P E R V 表达的 R T - P C R 技术，并对其特异性、敏感性等进行了研列卯。采集了6 个省市l o 个单位、5 个品种、1 7个猪群3 4 8 份外周血样品，根据通用的e n v 基因分型方法，用P C R 和R T - P C R 方法检测P E R Ve n v - A 、e n v B 、e n v - C 在版纳小型猪、五指I IJ 猪、巴马小型猪、贵州小型猪、中国实验小型猪等我国主要小型猪基冈组中的存在与表达情况 6 - 9 1
5、 。结果发现：从病毒存在的情况看，我国小型猪基因组中普遍存在P E R V ，其阳性率达1 0 0 。P E R V的存在以B 亚型最高( 9 5 4 0 ) ，其次为A 弧型( 7 4 4 3 ) 、C 亚型( 3 0 4 6 ) ；从病毒的表达情况看，五指山猪、巴马小型猪中P E R V - A 亚犁的表达率高于B 亚型，但所有的样品均未检测到P E R v - C 型的表达。从病毒主要结构蛋白的存在与表达情况看，小型猪基因组中不仅存在P E R Vg a g 、p o l 、洲特异性D N A ，而且都能够转录为R N A 。上述结果说明，我国小型猪外周血淋巴细胞基因组中存在P E R
6、V ，l 亚群的A 、B 、C 三种亚型，但仅有A 、B 两种亚型能够表达。P E R V A 、B 、C3 种亚型的同时存在，预示着小型猪群中存在着不同亚型病毒重组的可能性。【通讯作者】章金刚，T e l F a x ：0 1 0 - 6 8 1 6 4 9 7 1 ；E - m a i l ：z b a n g j g 例c b m i 扯6 1 62 0 1 0 广州一东莞前届国际小型猜学术论坛3 、小型猪内源性反转录病毒感染H E K 2 9 3 细胞的研究通过脂质体转染的方法，将含有n e o 基因的质粒p l R E S n e o 导入H E K 2 9 3 细胞中，利用G 4
7、1 8 的 选择特性，对转染细胞进行压力筛选，并对其进行了P C R 鉴定，培育得到G 4 1 8 抗性H E K 2 9 3 细胞( G 4 1 8 R 2 9 3 ) z o l 。将五指山猪( W Z S ) 、中国实验小型猪( C E M P ) 、巴马香猪( B P ) 、巴马小型猪( B M P ) 及贵州香猪( G Z M P ) 外周血淋巴细胞分别与G 4 1 8 R 2 9 3 细胞共培养，通过G 4 1 8 加压筛选，除去共培养体系中的猪外周血淋巴细胞，然后应用P C R 及R T - P C R 的方法对所制备的感染细胞模型进行系统鉴定l l l 】。通过上述方法已成功建
8、立了来自五指山猪、中国实验小型猪、巴马香猪、巴马小型猪及贵州香猪外周血淋巴细胞的猪内源性反转录病毒感染H E K 2 9 3 细胞的模型，证实了猪外周血淋巴细胞来源的P E R V 在体外也能够感染人源细胞系。以上实验结果，为研究P E R V 的生物学特性及病原安全性的评价搭建了技术平台，正在尝试应用上述反转录病毒细胞感染模型进行抗反转录病毒的药物筛选。4 、猪内源性反转录病毒5 非编码区启动子活性的分析根据对5 u T R 区的分析结梨1 2 】，对5 u T R 的不同功能区进行缺失，构建了含荧光素酶报告基因的系列5 U T R 缺失的载体，通过C O S 7 细胞系来鉴定5 U T R
9、 的启动子活性部位，萤光素酶报告基因检测结果表明；缺失R 区的5 U T R 显示出很强的启动子活性，U 3 重复区序列缺失的5 U T R 启动子活性显著下降。U T R 显示出较之L T R 强的启动子活性。缺失整个U 3 区的U T R 比仅缺失U 3 重复区的U T R 启动子活性强。通过本实验，我们认为转录调控元件不仪存在于U 3 、R 区，也存在于前导序列中，通过对P E R V5 U T R 转录因_ 了结合位点的分析，我们发现存在于前导序列中的一些转录因子结合位点，例如：N F k a p p a B 、I R F 与这种积极的影响有关。对于这些假定的转录因子的结合位点，有待于
10、进一步的突变或缺失这些位点的序列才能得到验证 1 3 , 1 4 】。5 、P E R V 前病毒全长克隆的构建与嗜人性P E R V 感染性和嗜性区域研究依据G e n b a n k 中P K l 5 P E R V - A ( 5 8 ) ( A J 2 9 3 6 5 6 ) 序列和我们的研究结果，设计合成了2 对重叠引 物分别用于扩增5 h a l f , 3 h a l f 两个片段，引物重叠处均包含唯一的N h e I 酶切位点( 位于4 9 6 8 b p 处) 。应用P C R 技术从五指山猪基因组D N A ( g D N A ) 中扩增出其5 h a l f , 37 h
11、 a l f 两个片段，将2 个重 叠片段通过中间载体p G E M T ，依次连接并克隆到低拷贝质粒载体p W S K 2 9 ，获得了五指山猪P E R V 前病毒全长克隆1 1 5 1 。进一步运用该方法，构建并筛选得到P E R V 感染性分子克隆，为深入研究P E R V 感染与整合机理奠定基础。6 、新型猪内源性反转录载体的构建由于P E R V 是以前病毒的形式存在于猪细胞基因组中的，根据基因同源重组的原理，在P E R V 清晰的分子生物学背景的基础上，用其构建新型的反转录病毒载体，对于转基因猪及P E R V 生物学 特性的研究具有重要的意义。 以W Z S P E R V
12、基因组全序列为基础，缺失其全部编码序列，用W Z S P E R V 的5 L T R 与3 L T R 及W Z S P E R V 的5 U T R 加上g a g 基凶的一部分( 以利于增加病毒滴度，并将起始密码子A T G 突变成 T A G 以降低组装形成野病毒的机率) 与Y L T R 分别替换小鼠干细胞病毒( M S C V ) 载体的相应区域，构 建出新型的猪内源性反转录病毒载体，将其命名为P M 1 和P M 2 。目前正在对此载体携带外源基因 的能力及表达水平进行评价。7 、结语6 1 72 0 1 0 广州一东莞前届国际小型猪学术论坛我们对我国小型猪中P E R V 的携
13、带、表达情况以及分子生物学特性进行了相关研究，并通过对 P E R V 全基因克隆，建立P E R V 感染性克隆，尝试定位影响嗜人性P E R V 感染性和嗜性的区域，这对 于阐明嗜人性P E R V 的生物学特性，评价其在猪_ 人异种移植中的病原安全性具有重要意义。此外，在克隆、鉴定并分析P E R V 的全长基凶组序列的基础上，构建缺失全部编码基凶序列的新型猪内源 性反转录病毒载体，有望为高效定点整合的转基凶猪的研究提供一种新的工具。致谢感谢科技部实验动物项目管理办公室对本课题的一贯关注。感谢云南农、l k 大学、贵阳中医学 院、贵州大学香猪研究所、广西大学动科院、广西五合七里香猪场、上
14、海大龙畜禽养殖有限公司、 上海交通大学动物科学系、重庆第三军医大学、中国农业大学、中国农科院畜牧所为本项目提供了 实验样品，使本项目得以顺利进行。 本项目为十五国家科技攻关重点项目( 2 0 0 4 B A 7 i 7 B 0 2 0 4 ) 、国家社会公益研究专项资金( 2 0 0 1D I A 4 0 0 3 6 ) 、国家自然科学基金( 3 0 2 7 0 9 8 9 、3 0 6 7 1 5 5 3 、3 0 7 7 1 6 1 0 、3 0 8 0 0 8 2 9 ) 、广西自然科学基金( 0 4 4 8 0 4 1 ) 资助项目。参考文献：【2 】【3 】【4 】【5 】 6 7
15、1 8 9 i o 1 1 1 2 E 1 3 1 4 M o z aA K , M e r t s e h i n gH ，H e r d e nT ，B a d e rA ，H a v e d c hA H e a r tv a l v e sf r o mp i g sa n dt h ep o r c i n ee n d o g e n o u sr e t r o v i m s ：e x p e r i m e n t a la n dc l i n i c a ld a t at oa s s e s st h ep r o b a b i l i t yo fp o r c
16、i n ee n d o g e n o u sr e t r o v i r u si n f e c t i o ni nh u m a ns u b j e c t s JT h o r a cC a r d i o v a s cS u r g 2 0 0 1 1 2 1 ：6 9 7 7 0 5 P a t i e n c eC ，T a k e u e h iYW e i s sR A I n f e c t i o no fh u m a nc e l l sb ya ne n d o g e n o u sr c t r o v i r u so fp i g s N a tM e d 1 9 9 7 ，3 ：2 8 2 - 2 8 6 P a r a d i sK ，L a n g f o r dQL o n gZH e n e i n eW ：S a n d s t r o m 只S w i t z
