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1、福建省第四届猪病学术研讨会论文集猪瘟的诊断技术和疫苗防控研究进展赖婷婷福建农林大学动物科学学院福州3 5 0 0 0 2摘要：本文综述了猪瘟的诊断和疫苗的研究进展，为合理应用疫苗及了解其发展趋势提供了技术指导关键字：猪瘟：诊断技术；疫苗猪瘟是一种高度接触传染性疾病，猪瘟是由猪瘟病毒引起的一种猪的急性和高度接触传染性疾病，以高热稽留、出血梗死和死亡率高为特征【l 】。目前已被列入国际兽疫局( O I E ) 申报的病毒性疾病之一。它能感染商品猪和野猪，给全世界养猪业造成巨大的经济损失。猪瘟病毒在体内可以攻击猪免疫系统，主要是那些来源于单核巨噬细胞系的细胞，能诱导周围未感染的淋巴细胞发生凋亡，但其
2、具体机制仍不清楚。强毒株能引起猪只出现免疫抑制和高致死率。该病引起的临床症状不仅取决于病毒株的毒力，还与其他因素有关，如动物的年龄和免疫状况。猪瘟在全球分布已经得到公认。该病在亚洲地区呈地方性流行，同时在一些国家的中部和南美洲也普遍流行。几十年前北美洲已经消灭了猪瘟，1 9 9 0 年初期欧洲联盟进一步实施猪瘟根除计划。该计划是以非接种策略为基础，淘汰已感染或接触感染群体的动物，同时限制动物或产品的进出口。疫苗接种策略仅允许在紧急状况下实施。然而，尽管实施了猪瘟根除计划，但病毒仍可以通过野猪或外来进口产品而被周期性引入欧盟，1 9 9 0 年曾在比利时、德国、荷兰、西班牙、意大利发生过该病。自
3、从2 0 0 0 年，该病出现在英国、西班牙、德国。我国在2 0 世纪7 0 年代后期也发现H C 的流行形式发生了很大变化。病程由急性变为慢性过程，临床症状由典型变为非典型的温和型猪瘟，症状显著减轻，发病率不高，疫势较缓和，死亡率减低，仔猪死亡率较高，成年猪较轻或可耐过，病理变化也不特征。在出现这些现象的地区和猪场，往往还伴随有多种原因引起的免疫失败，严重威胁养猪业的健康发展。猪场一旦发生猪瘟，特别是大型猪场，应迅速做出早期诊断，具有重大的意义。因猪瘟的扑灭有效方法是在猪群中尚未大批感染时，早期紧急接种猪瘟兔化弱毒苗，使猪群又获得一次免疫应答，可抵抗猪瘟野毒的攻击，及时控制猪瘟的发生和流行。
4、随着猪瘟的流行和发病特定发生了变化，从而给诊断带来很大的困难。随着对猪瘟分子生物学的研究深入，目前，实验室诊断技术不断完善，常用的方法有：1 冰冻组织切片直接荧光抗体饵A ) 试验许多国家和地区已将该法作为执行消灭H C 规划的法定诊断方法，同时也是我国实验室诊断C S F V最常用的方法之一。此法简便、快捷、可靠，在2h 内即可完成。作为F A 试验的样品应采自病猪或死猪的扁桃体、脾、肾、回肠末端，扁桃体应作为检查H C V 抗原的最重要器官。对于病程长的病猪，应重点观察回肠。该技术的关键是制备高效价的超免疫血清( 1 ：1 0 0 0 0 以上) ，提取I g G ，进行荧光标记。B V
5、D V 与C S F V 的抗原都能结合C S F V 抗体，但因B V D V 对猪无明显的病原性，也不能在猪体内大量增殖，可使细胞产生病变等，用这些特性可鉴别B V D V 与C S F V 。2 间接法酶联免疫吸附试验问接法酶联免疫吸附试验是目前应用最广、发展最快的免疫检测技术，是检测H C V 抗体的主要方法，也是监测免疫猪抗体水平的主要手段。是检测抗体的主要免疫学方法，也是监测猪群抗体水平的主要技术手段，常用于规模化养猪场的监测【2 】。根据E L I S A 的基本原理，发展出了间接E L I S A 、D o t E L I S A 、微波快速E L I S A 、竞争E L I
6、 S A 以及抗原捕获E L I S A 。间接E L I S A 是用C S F V 已知抗原包板，待检血清稀释后加入孔中，反应后加入H R P O 标记的葡萄球菌蛋白A ( P P A ) 或其他可与抗体结合物质，作用后加入底物显色，酶标仪读数后判定结果。周宗安等应用P P A E L I S A 测定接种兔化弱毒疫苗猪体的抗体水平，并与兔体中和试验进行比较，肯定了该法在C S F 免疫监测中的作用。杨晓梅等也应用此法检测规模化猪场的猪瘟抗体，取得了满意结果。但是由于1 2 9福建省第四届猪病学术研讨会论文集抗血清为多克隆抗体，无法区别疫苗免疫产生的抗体与C S F V 野毒自然感染产生的
7、抗体。D o t E L I S A 原理与E L I S A 相同，只不过将固相载体换为混合纤维素膜，比E L I S A 法操作更为简便。黄驳明等应用与猪瘟病毒有共同可溶性g p 抗原的牛病毒性腹泻病毒O r e g o nC 2 4V 毒株制备抗原，进行D o t E L I S A 成功地用于猪瘟血清抗体的监测，研制出猪瘟D o t E L I S A 诊断试剂盒。吴耀妹等建立了一种微波快速E L I S A ，操作程序与常规间接E L I S A 法相同，不同的是微波E L I S A 法将温育反应置于微波炉中进行，用以检测猪瘟抗体可使反应时间缩短至数分钟。张富强等基于单克隆抗体、抗
8、原表位的特异性和噬菌体拟位的“放大效应”，以单克隆抗体为包被抗体，以噬菌体拟位为“竞争指示剂”，以抗M 1 3 噬菌体主要蛋白p V I I I的特异性抗体( 标记H R P ) 为检测抗体，建立竞争E L I S A ，用于猪瘟病毒抗原检测。高华峰等应用抗原捕获E L I S A 方法分别对现行猪瘟疫苗毒及接种疫苗后产生定型热的兔脾、不同地区可疑猪瘟组织样品进行检测，结果表明该法对猪瘟强毒组织样品的检测效果良好，但对弱毒的检测并不敏感，提出可用此法进行野毒感染鉴别。3 单克隆抗体技术C S F V 只有一个血清型，但用单克隆抗体可以将C S F V 区分为不同的毒株，用于鉴别C S F V
9、强毒株与弱毒株。C S F V 与同属的B V D V 、B D V 存在较强的交叉免疫反应，能互相诱导一定程度的同源病毒抗体。应用杂交瘤技术制备C S F V 兔化弱毒、C S F 强毒、B V D V 、B D V 的特异性单克隆抗体，用于瘟病毒感染的鉴别诊断，可大量检测猪血清抗体。应用亲和层析法制成单克隆抗体酶联试剂后，可将疫苗免疫血清、强毒感染血清、混合血清、C S F 阴性血清区别开来。国外研制的对C S F V 、瘟病毒属其它病毒特异的单克隆抗体用于E L I S A ，可以将猪体感染C S F V 与感染其它瘟病毒区分开来。4 免疫金银染色技术( i m m u n o g o
10、l d - - s i i v e r s t a i n i n g ，I G S S )免疫金银染色技术以其灵敏度高、简便易行、试剂价廉无毒、样品可长期保存等优点而得到广泛应用。王镇【3 】等首次用I G S S 法对C S F VT 株感染细胞进行抗原检测，并成功地用这技术对C S F VC 株进行了检测，从而证明该方法可用于检测C S F V 在细胞中的增殖规律，可望成为C S F 疫苗生产中测定抗体效价的一种辅助性手段。5l m P C R 方法R T - - P C R 具有快速、敏感等优点，特别是样品不理想时更有价值。它的另一优点是可以测出扩增e D N A 的序列，快速确定病毒
11、特性，在流行病毒研究中更有价值。在此基础上又产生了e D N A 探针及R F L P确认P C R 产物。单独使用探针可能不太敏感，但若用c D N A 杂交方法与P C R 结合，则可通过利用高度保守区c D N A 序列为C S F V 的诊断提供有力的工具。进一步鉴定基因组，可将P C R 产物进行序列分析【4 5 。若用第二套引物去扩增第一次反应生成的P C R 产物的“亚片段”，此方法称为“套式P C R ”( n e s t e d - - P C R ) ，更可以提高检测的特异性。6 核酸探针杂交试验核酸探针技术是在分子标记的基础上，以病毒R N A 基因组为模板制备探针，在e
12、 D N A 合成之后，进行S o u t h e r n - - b l o t t i n g 。特异的核酸探针会在不同病毒基因组c D N A 上产生特异的条带。此方法具有特异性强、准确可靠的优点，但诊断费用较高。此法可用于不同毒株的分离和鉴定。C r u e i e r e 等、D a b l e等、C o l i j n 等利用C S F V 基因组R N A 构建的c D N A ，与B V D V 进行序列分析和比较，合成了6 个探针， 按照它们在病毒基因组的位置，根据特异的杂交条带可以区别C S F V 和B V D V 以及B D V 。4 疫苗研究现状为了控制C S F ，
13、人们从包括C S F V 分子生物学、抗原特异性、流行病学、发病机理及免疫机理等方面进行了广泛的研究，尤其是近年C S F 流行形式发生变化，根据传统疫苗的免疫效果，人们投入了大量的人力和财力进行新型疫苗的研制，已取得了一定成绩。4 1 传统疫苗传统的猪瘟疫苗主要包括灭活苗和弱毒苗。由于灭活苗有接种剂量大、免疫应答产生的时间长、有效免疫期短、成本高等缺点，很快被弱毒苗取代。1 9 5 6 年周泰冲、袁庆志等在佐剂和病毒培养技术发发展的基础上成功研制出中国系( 系) 猪瘟兔化弱毒疫苗，该疫苗以其产生免疫力快、免疫原性好、免疫谱广、安全性高、遗传性稳定等优点而在许多国家广泛应用，对C S F 的预
14、防控制起了重要作用。另外，日1 3 0福建省第四届猪病学术研讨会论文集本利用强毒A L D 株培育的弱毒疫苗株G P E 株和法国利用强毒A l f o r t 株培育的弱毒疫苗T h i v e r v a l 株都已应用多年，效果比较明显【6 】。利用弱毒茁免疫猪能达到很好的免疫效果，但是弱毒茁也有其不足之处：难以区分免疫猪与自然感染C S F V 猪，直接影响进出口贸易和C S F 的诊断。因为发达国家已基本消灭猪瘟或停止使用弱毒疫苗，不从任何有猪瘟和注射猪瘟弱毒疫苗的国家进口猪类制品。对隐性感染和持续性感染猪，野毒H C 抗体处于动态平衡，弱毒苗不能彻底阻断其传播途径，野毒仍可以低水平
15、传播。弱毒疫苗对保存及运输过程中的温度要求较高，对免疫程序和免疫时机的精确选择要求也高。母猪妊娠早期接种弱毒苗有通过胎盘感染胎儿，造成死胎或弱仔并成为持续带毒者，成为新疫源的可能性。弱毒疫苗的长期普遍使用改变H C V 原有的生态环境和病毒群落，使得猪瘟流行毒株远离疫苗毒的方向演化，给猪瘟的控制将可能带来新的困难。基于弱毒苗不足，故研究能鉴别是野毒感染还是疫苗免疫新型疫苗势在必行。4 2 新型疫苗随着分子牛物学技术的发展，对病毒的基冈组机构及功能性蛋白的研究深入，现已出现基因工程亚单位疫苗、病毒活载体疫苗、核酸疫苗等。4 2 1 基因工程亚单位疫苗利用真核细胞高效表达系统来表达H C V 免疫
16、蛋白，并以此表达产物为抗原可制造疫苗。杆状病毒昆虫细胞系统可高水平表达外源蛋白基因，而且大部分蛋白质的加工过程与哺乳动物细胞相同。H u l s t 【7 1 等( 1 9 9 3 ) 将H C VE 2 基因c D N A 重组入核型多角体病毒( A C N P V ) ，并在S F 2 1 细胞中表达。用2 0 1 0 0 m g 的表达蛋白免疫猪，可抵抗1 0 0 L D 5 0 的H C V 强毒攻击，其诱导产生的中和抗体水平远高于由弱毒疫苗免疫产生的水平。目前，蛋白的表达水平已被提高至6 0 u g m L ，该疫苗于1 9 9 8 年被列入欧洲药典。陈创夫等构建了E 2 基因与I L 一2 、I L 一3 的双表达真核表达载体p l R S TI L 一2 与p l I S TI L 一3 ，转染B H K 一2 1 细胞。试验进一步证明，细胞因子与目的基因构建的双表达基凶疫苗能有效提高疫苗的免疫效果。由于该疫苗牛产技术具有安全、稳定、可规模化等优点，同时又可根据流行毒的变化，更换合适的E 2 基因，因此具有广阔的应用前景瞄J 。4
