《NT3基因转染在防治庆大霉素耳毒性作用的实验研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《NT3基因转染在防治庆大霉素耳毒性作用的实验研究（120页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、第四军医大学博士学位论文NT-3基因转染在防治庆大霉素耳毒性作用的实验研究姓名：邓志宏申请学位级别：博士专业：耳鼻咽喉科学指导教师：王锦玲;杨安钢2003.5.1独创性声嚼学校严谨的学风与优良的科学道德本人声明所呈交的论文是我个八导下进行的研究工作及取得的研究成果尽找所知除了文中特别加致谢的地方9 ，论文中雨包含其他八已经发表或撰写过的研究成果八或他八已申请学位藏其他用途使用过的成果与我一同工作的同志阿i 做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了致谢学位论文与资料若有不实之处，本八承担一切相关责任l 支作青萱为：? 王蔓_ 日期：兰：! ! ：! ：兰一保护知识产权声明全了解第四军医大学
2、有关保护知识产权的现定，即：研究生在校攻读论文I 作的知识产f 单位屑第四军医大学本八保证毕业离校后，发使用论文工作戚果时詈各单位仍然为第四军医大学学校有权保留送复印件，允许论爻被查闻和借闻：学校可以公布论文的全部或部分内内容除9 ) ，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文论文作者蔓名：j 羔壹墨L 一导师签名：! ! ! l L 日期：2t 。j 。第四军医大学博士学位论文英文缩写词A B Ca v i d i n b i o t i n - - p e r o x i d a s ec o m p l e xP B Sp h o s p h a t eb u f f e r e ds
3、a l i n eN T - 3n e u r o t r o p h i n - 3t r kr e c e p t o rt y r o s i n ek i n a s eA B Ra u d i t o r yb r a i n s t e mr e s p o n s eD P O A Ed i s t o r t i o np r o d u c to t o a c o u s t i ce m i s s i o nS C CS c h w a n ne e l l S G CT M EN FG ME G F P0 H CI H Cs p i r a lg a n g l i
4、o nc e l lt r a n s m i s s i o ne l e c t r o n i cm i c r o s c o p en e u r o f i l a m e n tg e n t a m i c i ne n h a n c e dg r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i no u th a i rc e l li l i n e rh a i re e l l卵白素一生物素一过氧化物复合物磷酸盐缓冲液神经营养素一3受体酪氨酸激酶听性脑干反应畸变产物耳声发射雪旺细胞螺旋神经节细胞透射电镜神经丝蛋白庆大霉素增强型绿色荧光蛋白外
5、毛细胞内毛细胞第四军医大学博士学位论文中文摘要神经营养素一3 ( n e u r o t r o p h i n 一3 ，N T 一3 ) 是由7 7 4 个氨基酸组成的、与神经结构和功能密切相关的神经营养因子，调控着神经元的发育、生长、分化和生存，对维持神经系统的正常功能起着重要作用，也是内耳发育最基本的营养因子。我们采用R T P C R 的方法，从人肝脏组织中克隆N T - 3c D N A 基因，构建携带绿色荧光蛋白( e n h a n c e dg r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n ，E G F P ) 标签的真核表达载体p I R
6、 E S 2 一E G F P N T 一3 ，并采用阳离子脂质体介导的方法，将其分别转染耳蜗内不同组织细胞，观察转染细胞N T 一3 表达和分布情况；将阳离子脂质体一质粒复合物微量注入豚鼠耳蜗，观察其对豚鼠庆大霉素耳毒性听力损失的保护作用，为今后的临床治疗研究提供实验依据。结果如下： 一、N T - 3 - c D N A 基因的克藿，重组质粒p l 眭跎- E 删T _ 3 的构建及其寰达活性的检测1 N T - 3 一c D N A 基因的克隆及重组真核表达载体的构建针对人的N T 一3 一c D N A 序列，设计了包含起始密码子和终止密码子的一对引物，分别在其5 端加上艮胡I 及B
7、a m HI 酶切位点，经R T P C R 扩增的7 7 4 b p 的特异性片段插入到p U C l 9 载体后筛选出p u c l 9 一N T 一3 一c D N A 阳性克隆，经序列测定，证实与序列号“N T 一30 0 2 5 2 7 ”的同源性为1 0 0 。将测序正确质粒p U C l 9 一N T 一3 进行经如胡I B a m HI 双酶切，切下的N T 一3 片段定向克隆到真核表达载体p I R E S 2 一E G F P ，随机挑选数个菌落，提取质粒，经屁胡I B a m HI 双酶切及P C R 鉴定，成功构建重组质粒p I R E S 2 - E G F P N
8、T 一3 。2 稳定表达N T - 3 的N I B 3 T 3 细胞的建立及鉴定以阳离子脂质体作为载体，将携带有外源性基因N T 一3 的重组质粒p I R E S 2 - E G F P N T 一3 转染小鼠成纤维细胞，并进行R T P C R 、W e s t e r n b l o t 及第四军医大学博士学位论文免疫组化鉴定。结果：得到抗G - 4 1 8 的阳性细胞克隆：R T P C R 的产物约为7 4 4 b p ：W e s t e r n b l o t 可见一清晰的蛋白条带，与N 卜3 的蛋白分子量相符合。N T 一3 免疫组化染色结果显示转染N T 一3 一c D N
9、 A 的N I H 3 T 3 细胞胞质呈棕黄色着色。二、N T - 3 体外转染对耳蜗组织细胞生长的影响1 重组质粒p 1 1 L E S 2 - E G F P - N T - 3 转染对豚鼠耳蜗成纤维细胞生长的影响用阳离子脂质体介导的方法将真核表达载体p I R E S 2 E G F P N T 一3 瞬时转染豚鼠原代耳蜗成纤维细胞，转染4 8 h 后分别在荧光显微镜下及用免疫组化方法观察转染细胞表达N T 一3 的情况。结果：转染后4 8 h 在荧光显微镜下观察到呈绿色荧光的成纤维细胞，N T 一3 免疫组化染色结果显示转染N T - 3 的成纤维细胞胞浆呈棕黄色着色，转染空载体的成
10、纤维细胞免疫组化染色呈阴性。2 重组质粒p I R E S 2 - E G F P - N T - 3 转染对豚鼠耳蜗雪旺氏细胞生长的影响采用阳性脂质体介导法将重组质粒p I R E S 2 一E G F P - N T - 3 转染雪旺细胞，观察外源性N T 一3 对雪旺细胞生物学行为的影响。结果：分离、纯化得到高纯度的雪旺细胞；将重组质粒转染雪旺细胞，与对照组相比，转染N T - 3 基因的雪旺细胞不仅细胞形态正常，经N T - 3 抗体免疫组化染色见N T - 3 转染组雪旺细胞胞浆呈深棕色着色，轴突着色清晰可见，与对照组相比，细胞突起明显变长；空载体转染组及空白对照组胞浆及轴突着色均较
11、淡，对各组胞浆着色进行半定量分析结果表明，N T 一3 基因转染组其灰度值显著低于对照组( P O 0 5 ) 。庆大霉素停药1 d时，与正常对照组相比，空载体及P B S 组A B R 阈值显著提高( p 0 0 5 ) ，而空载体及P B S 组A B R 阚值升高显著，与N T 一3 组存在显著性差异( p O 0 5 ) ，而空载体及P B S 组A B R 阈值升高显著( p O 0 5 ) T h eA B Rt h r e s h o l d sw e r es i m i l a rw i t l lt h er e s u l t so fD P O A E T r a n
12、s g e n ee x p r e s s i o nw a sd e t e c t e dt h es p i r a lg a n g l i a ，t h en e v e rf i b e r ,t h eo r g a no fC o r t i ，t h es t r i av a s c u l a r i s ，a n du pt o4 w e e k s T h eh a i rc e l l sw i 山t h eF I T C p h a l l o i d i ni m m u n o h i s t o c h e m i c a ld y e i n gs h
13、o w e dt h a to u th a i rc e l l s ( O H C s )w e r ep a r t l ya b s e n ta tl d ，a n dl i t t l es e v e r i t ya t2 wi nt h eN T - 3g r o u p s W h i l et h eO H C sw e r ea p p a r e n t l ya b s e n ta tl d ，a n dm o r es e v e r i t ya t2 wi nt h ec o m p a r e dg r o u P S 3 ) P r o t e c t
14、i o no fN T - 3g e n et r a n s f e c t i o no nt h ea f f e r e n tn e r v es y s t e mo ft h eg u i n e ap i gc o c h l e at r e a t e dw i t hg e n t a m i e i nT h el i p o s o m e - p l a s m i dc o m p l e x ( p I R E S 2 一E G F P - N T - 3 ) w a si n j e c t e di n t ot h eg u i n e ap i gc o
15、 c h l e a ，t h r e ed a y sl a t e rt h eg u i n e ap i g sw e r et r e a t e dw i t hg e n t a m i c i n ( 1 2 0 m g k g ，1 4 d ) T h e nt h ep a t h o l o g i cc h a n g e si nt h ea f f e r e n tn e r v ee n d i n g ，a f f e r e n tn e r v ef i b e r sa n dc e l lb o d yw e r ee v a l u a t e dw
16、 i t h t r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p ya tI d ，2w e e k sr e s p e c t i v e l ya f t e rs t o pg e n t a m i c i na p p l i c a t i o n ，w h i l et h eD P O A Ea n dA B Rw e r em e a s I l r e d R e s u l t sA tl da R e rs t o pg e n t a m i c i n ，c o m p a r e dw i t ht h en o r m a l ，t h eD P O A Eo f t h eg u i n e ap i g st r a n s f e c t e dw i t hb l a n kv e c t o ra n dP B S 、e r ee v i d e n t l yd r
