《再生障碍性贫血骨髓组织HCMV活动性感染的研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《再生障碍性贫血骨髓组织HCMV活动性感染的研究（40页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、华中科技大学硕士学位论文再生障碍性贫血骨髓组织HCMV活动性感染的研究姓名：桂敏申请学位级别：硕士专业：儿科学指导教师：周东风;金润铭20080501华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 1 英语缩略语及中文对照英语缩略语及中文对照 RT-PCR：Reverse transcription polymerase chain reaction 逆转录聚合酶链反应 RT-PCR in situ： 原位逆转录聚合酶链反应 HCMV： Human cytomegalovirus 人巨细胞病毒 AA： Aplastic anemia 再生障碍性贫血
2、（再障） MDS： myelodysplastic syndrome 骨髓增生异常综合征 HCMV mRNA： 人巨细胞病毒信使核糖核酸 FCM：Flow cytometry 流式细胞术 MMA：Methyl methacrylate 甲基丙烯酸甲酯 HEMA：Poly-2-hydroxyethy methacrylate 甲基丙烯酸羟乙基酯单体 NBT/BCIP：Nitro blue tetrazolium/5-Bromo-4-chloro-3-indoly phosphate 四唑氮蓝/5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐 CD34：Cluster of differentiation 34
3、白细胞分化抗原 34 PLL：Polylysine 多聚赖氨酸 PBS：Phosphate buffered solution 磷酸盐缓冲液 TBS：Tris-HCl buffer saline Tris-HCl 缓冲液 RNasin：Recombinant ribonuclease inhibitor 核糖核酸酶抑制剂 DEPC：Diethyl pyrocarbonate 焦碳酸二乙酯 BSA：Bovine serum albumin 牛血清白蛋白 独创性声明独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不
4、包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体， 均已在文中以明确方式标明。 本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体， 均已在文中以明确方式标明。 本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国
5、家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密， 在 年解密后适用本授权书。 不保密。 （请在以上方框内打“” ） 学位论文作者签名： 指导教师签名： 日期： 年 月 日 日期： 年 月 日 本论文属于 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 2 再生障碍性贫血骨髓组织再生障碍性贫血骨髓组织 HCMV 活动性感染的研究活动性感染的研究 华中科技大学同济医学院附属协和医院儿科 430022
6、 硕士研究生： 桂 敏 导 师： 周东风、金润铭 教授 摘摘 要要 目的目的：建立一种在骨髓塑料包埋切片上行原位逆转录聚合酶链反应（RT-PCR in situ，原位 RT-PCR）技术的方法，明确再生障碍性贫血患儿骨髓组织人巨细胞病毒（HCMV）活动性感染的组织学依据；通过流式细胞术了解再障患儿骨髓内 HCMV活动性感染和骨髓 CD34+ 细胞/有核细胞百分比之间的关系，结合二者探讨骨髓内HCMV 活动性感染对再障患儿骨髓造血功能的影响。 方法：方法：临床筛选再生障碍性贫血患儿 26 例，全部除外 HBV、HCV、HIV、细小病毒 B19、EBV、细菌、药物、结缔组织病及遗传代谢性疾病。 取
7、患儿骨髓活检组织，采用甲基丙烯酸甲酯（MMA）低温塑料包埋方法包埋骨髓活检组织，制备骨髓组织塑料包埋切片；将切片置于 Eppendorf 管反应液内进行原位逆转录并扩增，于显微镜下原位检测骨髓组织中 HCMV mRNA 表达。 同时取患儿骨髓液标本，每份分成两部分：一部分骨髓液提取 RNA 进行逆转录聚合酶链反应并电泳，检测是否有HCMV mRNA 表达作为原位 RT-PCR 的对照。 将另一部分骨髓液进行流式细胞术，检测骨髓 CD34+ 细胞/有核细胞的百分比。 另收集 5 例其它疾病患儿的正常骨髓液标本做为对照组。 结果：结果： 9例（34.6）骨髓塑料切片检测到 HCMV mRNA 表达
8、；阳性细胞多为骨髓实质细胞，呈局灶性或片状分布，阳性信号主要位于细胞胞浆内，少量出现在部分细胞的胞核。 普通液相 RT-PCR 检测 11 例 （42.3） 骨髓液中有 HCMV mRNA表达。两种检测方法阳性率差异无显著性意义（P 0.05） ，其中原位 RT-PCR 检测阳性结果的 9 例患儿抽取骨髓液进行普通液相 RT-PCR 检测结果均为阳性。5 例对照组华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 3 骨髓均未检测到 HCMV mRNA 表达。 再障患儿骨髓 CD34+ 细胞/有核细胞的平均百分数为(0.26 0.21)，明显低于正常对
9、照组水平。其中，再障患儿骨髓 HCMV mRNA 阳性组的 CD34+ 细胞百分比为(0.13 0.07)， 低于 HCMV mRNA 阴性组(0.34 0.23)（P 0.05）. In addition, nine myelo-fluid samples from patients who had positive HCMV mRNA expression through RT-PCR in situ are all detected positive through routine RT-PCR. HCMV mRNA positive expression are not detecte
10、d in five myelo-fluid samples from normal contrast group. The average ratio (CD34+ cell/ karyocyte) of aplastic anemia patients is (0.26 0.21)， which is lower than the that of normal contrast group obviously. Moreover, the ratio (CD34+ cell/ karyocyte) of HCMV mRNA positive group from aplastic anemi
11、a patients is (0.13 0.07)， which is lower than the ratio of HCMV mRNA negative group from aplastic anemia patients (0.34 0.23)（P 0.05） 。 其中原位 RT-PCR 检测阳性的 9 例患儿抽取骨髓液进行普通液相 RT-PCR 检测结果均为阳性，提示两种方法的检测结果具有较好的一致性。5 例对照组患儿的骨髓液均未检出 HCMV mRNA 表达。 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 14 图 1.1 原位 RT
12、-PCR 法检测再障患儿骨髓组织人巨细胞病毒 mRNA 阳性，苏木素轻度衬染下， 可见感染细胞内紫色阳性信号 （显色系统为碱性磷酸酶NBT/BCIP， 放大倍数：上面两图为400 倍，下面两图为1000 倍） 图 1.2 原位 RT-PCR 法检测再障患儿骨髓组织人巨细胞病毒 mRNA 表达的阴性对照 （放大倍数： 400 倍） 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 15 图 2图 2 原位 RT-PCR 及普通液相 RT-PCR 结果电泳鉴定图（目的条带大小为 150bp） M：DNA Marker（从上到下依次为 600，500，40
13、0，300，200，100 bp） ； 左图： 泳道 1：阴性对照； 泳道 26：普通液相 RT-PCR 电泳结果。 右图： 泳道 1、2：原位 RT-PCR 扩增反应液电泳结果； 泳道 3、4：普通液相 RT-PCR 阳性标本电泳结果。 4 3 2 1150bp6 5 4 3 2 1华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 16 4 骨髓骨髓 HCMV mRNA 阳性表达与髓外阳性表达与髓外 HCMV 感染的关系：感染的关系： 9 例原位 RT-PCR 检测骨髓 HCMV mRNA 阳性表达的再障患儿中，8 例外周血血清抗 HCMVIgM（
14、+） ，另 1 例患儿抗 HCMVIgM（-） ，抗 HCMVIgG（+） ，但尿 HCMV 快速培养（+） 。2 例普通 RT-PCR 结果阳性而原位 RT-PCR 阴性的患儿，血清抗 HCMVIgM（+） 。5 例再障患儿血清 HCMVIgM 抗体和（或）尿快速培养呈阳性，骨髓 HCMV mRNA 为阴性。血清特异性抗体和尿快速培养均为阴性者，未检测到骨髓内有 HCMV mRNA 阳性表达。 5 流式细胞术检测再障患儿骨髓流式细胞术检测再障患儿骨髓 CD34+ 细胞细胞/有核细胞百分比的结果：有核细胞百分比的结果： 将上述两种 RT-PCR 方法检测结果一致的 24 例再障患儿（除去 2
15、例普通液相RT-PCR 结果为阳性而原位 RT-PCR 为阴性的患儿）和 5 例对照组患儿的骨髓液进行流式细胞术检测。结果显示，再障组患儿骨髓 CD34+细胞/有核细胞的平均百分比为（0.26 0.21），对照组患儿为（1.57 0.45），再障组患儿的骨髓 CD34+细胞水平明显低于对照组患儿（见图 3） 。结合 RT-PCR 的结果将再障组患儿分为 HCMV 活动性感染阳性组及阴性组，比较两组患儿的骨髓 CD34+细胞水平，结果显示，骨髓HCMV 活动性感染阳性组的患儿 CD34+细胞百分比明显低于阴性组患儿（P0.05） ，见表。 表 再障组骨髓 HCMV 活动性感染与 CD34+细胞的
16、关系 n CD34+细胞百分比 （） t 值 P 再障 HCMV(+)组 9 0.130.07 再障 HCMV(-)组 15 0.340.23 3.30 0.05 注：两组总体方差不等，采用近似 t 检验，t3.30，P0.05 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 17 讨讨 论论 一、人巨细胞病毒及危害一、人巨细胞病毒及危害 人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus，HCMV) 属疱疹病毒亚科，其基因是双股DNA，240Kb，有脂质包膜，衣壳为二十面体，衣壳内核酸为 DNA；直径为180250纳米，形态与单纯疱疹病毒相似，具有潜伏-活化的生物学特征。HCMV是一种在人群中广
