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1、华中科技大学硕士学位论文原生质体融合选育高效脱氮菌姓名：朱春花申请学位级别：硕士专业：市政工程指导教师：章北平20080605I 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 摘摘 要要 自然水体中氨氮污染问题日趋严重各种氨氮脱除新工艺的开发成为污水处理研究的热点之一近些年来人们已开始较多地运用分子生物学和遗传工程技术的手段去改造微生物菌种特性使之获得高降解活性从而改善生化处理装置的效能 传统生物脱氮处理工艺包括氨化作用硝化作用和反硝化作用三个过程在这三个过程中起主要作用的是亚硝化细菌硝化细菌和反硝化细菌分离纯化出这三类脱氮功能菌并将其应用于污
2、水处理中为污水生物脱氮新技术的开发奠定基础通过原生质体融合技术构建工程菌能够获得比亲本菌株具有更优性状的菌株该技术在水处理中的应用已经有许多报道本文通过对菌源的富集分离纯化分别得到三株亚硝化细菌硝化细菌和反硝化细菌对纯化出的菌株进行脱氮效能测试表明菌株 y3x3 和 f1 较其他菌株具有更优脱氮效果进一步分析鉴定得出 y3 为亚硝化球菌属x3 为硝化球菌属f1 为反硝化杆菌属通过原生质体融合技术选取亚硝化菌株 y1y3硝化菌株 x1x2反硝化菌株 f1f3 作为融合亲株得到融合子 y13f12通过进一步鉴定判定它们分别为硝化球菌和反硝化杆菌通过脱氮效能测试得出y13 较亲本菌株 y1 氨氮去除
3、率提高了 15.9%f13 较其亲本菌株 f3 硝态氮去除率提高了 43.4%说明通过原生质体融合技术可以得到优于亲本菌株脱氮效率的菌株 关键词硝化细菌反硝化菌分离纯化原生质体融合脱氮效率 II 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 Abstract Nitrogen pollution in nature water becomes increasingly serious, the development of new denitrify process attracted great attention of the sewage
4、 disposal researchers. In recent years, more people have begun to use molecular biology and genetic engineering techniques to transform characteristics of microorganisms and to obtain high degradation activity, then can improve the effectiveness of biological and chemical treatment plant. Convention
5、al biological nitrogen removal process includes the process of ammoniation, nitrification and denitrification. Ammonifiers, nitrobacteria and denitrifying bacteria play a determinative role in these three processes. Isolating and screening those bacteria and applying them in wastewater treatment can
6、 be a basis for the developing of new technology of nitrogen removal process. To construct engineering bacteria through protoplasts fusion can breed superior strain. The application of protoplasts fusion in wastewater treatment has been reported a lot yet. This paper have purified and isolated three
7、 strains of ammonifiers, nitrobacteria and denitrifying bacteria separately. The nitrogen removal rate of strains y3x3 and f1 are higher than the other strains. Y3 is nitrosococcus, x3 is nitrococcus, and f1 is denitrifying bacillo. Used y1, y3; x1, x2; and f1, f3 as parent strains separately cultiv
8、ated fusant y13, f12. Y13 and f12 can be identified as nitrococcus and denitrifying bacillo. Strain y13 improved the nitrogen removal rate by 15.9 percent compared with strain y1, and strain f13 improved the nitrogen removal rate by 43.4% percent compared with strain f3. Those result can proved that
9、 protoplasts fusion can breed superior strain than parent strain. KeywordsAmmonifiers; Nitrobacteria; Isolation and purification; Protoplasts fusion; Nitrogen removal rate 独创性声明独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果尽我所知除文中已经标明引用的内容外本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果 对本文的研究做出贡献的个人和集体均已在文中以明确方式标明本人完全意识
10、到本声明的法律结果由本人承担 学位论文作者签名 日期 年 月 日 学位论文版权使用授权书学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留使用学位论文的规定即学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版允许论文被查阅和借阅本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索可以采用影印缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文 保密 在 年解密后适用本授权书 不保密 请在以上方框内打 学位论文作者签名 指导教师签名 日期 年 月 日 日期 年 月 日 本论文属于 1 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位
11、 论 文 1 前言前言 1.1 课题背景课题背景 近年来自然水体中氨氮污染问题日趋严重因此各种氨氮脱除新工艺的开发成为污水处理研究的热点之一其中生物脱氮工艺具有经济有效易操作等特点最受人们青睐传统的包含硝化和反硝化的脱氮工艺在污水处理中应用广泛但这种工艺要求有足够的能源和碳源越来越多的研究关注如何使该工艺更加经济有效1为了开发高效生物脱氮新技术水处理工作者越来越重视微生物学基础研究在废水生物处理中微生物是净化作用的主体在传统的废水生化处理技术中起作用的微生物通常是由当地自然环境中存在的多种类型的微生物经培养驯化后形成的优势种群构成这些种群往往不能适应一些生物难降解工业废水的处理近些年来人们已开
12、始较多地运用分子生物学和遗传工程技术的手段去改造微生物菌种特性使之获得高降解活性从而改善生化处理装置的效能或创建新的高效废水生化处理工艺传统的生物处理法是对当地自然生长的微生物群体加以驯化繁殖而利用这些微生物不能适应降解废水中人工合成的复杂的难降解有机物致使废水处理设施不能达到预期的要求20世纪70年代以来针对某些生物难降解有机废水有人选育出具有较高降解活性的菌种并进行提纯培养后用于废水处理初步显示出一定的优越性但其降解污染物的能力也有限为适应当代废水的处理要求人们开始对微生物及其酶系进行改造定向培育降解能力更高的菌种以生物工程手段构建的具有降解环境中复杂的难降污染物的微生物菌种称为工程菌2目
13、前有两种渠道得到优势菌种3一是从自然界通过驯化分离得到另一种就是通过人为方法构造高效基因工程菌 随着现代生物技术的发展将目的基因导入宿主菌进行克隆和表达从而构建基因工程菌的报道己有不少但基因工程菌用于大规模工业生产的还为数不多经典的诱变育种仍是目前最重要的遗传育种手段特别是对遗传背景不很清楚的对象诱变育种更是必不可少 原生质体融合方法不仅能显著提高重组频率与常规诱变育种相比还具有定向育种的含义它不仅广泛应用于霉菌酵母菌放线菌和细菌并从株内株间发展到种内种间打破种属间亲缘关系实现属间门间甚至跨界融合4对于微生物影响废水处理效果的研究一直有长足的进步早期是通过培养基来了解废2 华 中 科 技 大
14、学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 水中各微生物的存在状况且可以进一步自废水中筛选出特定的微生物经过功能评估作为废水处理用的生物制剂将之放回到废水中进行废水处理以期强化处理效果为使研究更加有效必须锁定目标菌株并将其分离纯化出来然后进行进一步的讨论以免受其他菌种的干扰 直接投加从自然界中筛选的优势菌种或通过基因组合技术产生的高效菌种降解微生物是生物强化技术应用最为普遍的方式之一这种特效微生物经过筛选培养驯化之后投入到废水中以目标污染物为唯一碳源和能源废水中的微生物可以附着在载体上形成高效生物膜或以游离的状态存在在生物降解反应中微生物细胞的共生或互生现象普遍
15、存在究其机理可能是由于微生物之间相互提供了彼此生长或发生降解反应所需的某种生长因子或者是由于互补作用形成一个所需降解酶活性很高的反应体系通过原生质体融合不仅可以集中双亲的优良性状而且还可能产生双亲所没有的一些新性状即使双亲具有相同的功能也有可能融合出功能效率更好的菌株因此通过质体融合技术选育新菌种并将其应用于废水处理工艺有利于提高废水处理效果 1.2 研究内容和目的研究内容和目的 本课题研究内容通过富集分离纯化筛选出亚硝化硝化以及反硝化三个不同阶段的脱氮功能菌获得三类细菌的纯培养物并对其脱氮效率进行测定利用抗药性标记选择上述菌种作为亲本菌株进行原生质体融合通过对融合子脱氮效率的测定进一步筛选融
16、合子以期获得脱氮效率优于亲本菌株的脱氮细菌 研究如何更加有效的富集分离纯化出硝化细菌和反硝化细菌有利于脱氮制剂的进一步制备通过原生质体融合获得优于亲株脱氮效能的脱氮细菌为获取高效脱氮菌开辟新的技术手段为进一步推进氮素污染治理的新技术和新方法奠定一定的基础 3 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 2 微生物与脱氮微生物与脱氮 2.1 微生物在生物脱氮中的作用微生物在生物脱氮中的作用 污(废)水中的氮一般以氨氮和有机氮的形式存在 通常是只含有少量或不含亚硝酸盐和硝酸盐形态的氮在未经处理的污水中有可溶性的氮也有非可溶性的氮可溶性有机氮主要以尿素和氨基酸的形式存在部分非可溶性有机氮在初沉池中可以被去除在生物处理过程中大部分的非可溶性有机氮转化成氨氮和其他无机氮却不能被有效地去除5传统废水生物脱氮的基本原理就在于在有机氮转化为氨氮的基础上通过硝化反应将氨氮转化为亚硝态氮硝态氮再通过反硝化反应将硝态氮转化为氮气从水中选
