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1、华支睾吸虫成虫c D N A 表达文库的构建与筛选昊秀萍1 ，高丽芳1 ，张玲1 ，邓洪宽1 一，刘相叶1 ，叶春艳1 ，王子见，王学林t ，王峰p ，刘明远t ( 1 蛊林大学人兽共患瘸研究所人兽共患病教育部重点实验室，吉耱长春1 3 0 0 6 2 ；2 。法国食鼹卫生安全局， 巴黎法国9 4 7 0 3 )攘要：势了获得华支睾吸虫赢虫襄强反应原挂抗原基茜，首先利簏；u Z A P 裁体构建华支睾吸虫成虫c D N A 表迭文库：即从我国东北疫区( 镇赉县) 家犬脾管内分离收集华支睾吸虫成虫，采用T r i z o lR e a g e n t提取其总R N A ，O l i g o (
2、d T ) 纤维素柱纯化m R N A ，反转录合成第l 链c D N A 及第2 链c D N A ，用C H R O M AS P I N - 4 0 0 柱离心层橱施化君，与裁体k Z A PE x p r e s s 连接，体外包装后成功获得我溺东北疫区华支睾吸虫成虫c D N A 表达文库。文库容量为1 5 x 1 0 6p f u ，重组率为9 9 ，插入片段长度在0 4 2 Ok b 之间，扩增史霹的漓度为1 5 x 1 0 托p f u m L 。然后剁用免疫学方法对该c D N A 表达文库进行筛选：以鸯然感染华支睾吸虫的人血清为抗体探针，从2 o x l 个重组噬萄体筛选强
3、反应原性抗原基因，对筛选出的强反应原性克隆进行洲序，利用相关分子生物学软件进行序列分析。共获得4 1 个阳性克隆，测序结果分析表明，这些c D N A s撂据其编码戆蛋白可分受以下几种，印与来鸯华支睾吸虫的甘氯酸_ 2 、熊氨酸一2 及C s 4 4 抗原高露源的基因及分别与来自N e m a t o s t e U av e c t e n s i s 的未知蛋白、转录延伸因子及果蝇C G 3 4 4 6 基因编码蛋白较低同源性的基因。本研究结果为进一步对华支睾吸虫抗原的生物学特性研究及应用奠定理论基础争实验依据。关键词：华支睾吸虫；成虫；c D N A 文库；筛选；抗原基因华支睾吸虫病又称
4、肝吸虫病，是由华支睾吸虫成虫寄生在人的肝胆管内所引起的以肝胆病变为主的一静危害非常严重鲶食源性人善共患寄生虫病。华支睾吸虫成虫主要寄生在人、犬、猫、猪等哺乳动物的肝胆管内，成虫排出的虫卵经胆汁入小肠后随粪便排出体羚。鑫1 8 7 5 年发瑷华支褰暖虫以来，善蠹磐众多学者对华支睾吸虫瘸进行了大匿的研究工作，然而至今仍未能找捌对该病的理想诊断与防治措施，华支睾吸虫病的感染率依旧呈现明显的上升趋势【M 。究其根源除与遴未发现有效的预防性疫萤有关外，与尚未找到有效的诊断方法以控制传染源、切断传播途径密切相关。由于华支睾吸虫抗原成分的复杂性，寻找特异、敏感的适宜免疫学诊断黪抗缘并非易事，但随着分子生物学
5、技术的发展使得这一难题的解决成为可能。通过基金项目：国家自然科学基金资助项目( N S l C 3 0 7 0 0 6 0 0 ) ；吉林省科技厅项目( 2 0 0 6 0 4 1 7 )第椎者：吴秀萍，在读博士生，讲师，E - m a i l ：w u x p 3 3 C 鲫a h o o c o i n 。逶最终者：刘暌远，褥，教授，圭要获事人兽共意疯及食品安全褒究，E - m a i l ：l i u m y 3 6 1 6 3 。C O m a ；王峰，博士，教授，主要从事人兽共患病研究，E m a i l ：w a n 出n 9 1 2 3 4 c n y a h o o c o m
6、 c l l 。4 爱。_ ，- ，- ，t - _ ，t I t - _ _ _ _ ，t _ - ，l ，l _ ，t ，t ，t “I _ 【r 攀啦j - ，t _ _ _ ，- ，I - - _ - - ，t - _ - _ 蠢，- “采集的血清，其中大部分免疫组的免疫源含有2 6k D a制试纸条和I H A 等适合基层应用的试剂盒，以推动其昀G S T ( 以融合蛋白形式存在) 或r s j 2 3 ，而r S j 2 3 和在血吸虫病防治工作中的应用。实验中，r s j 3 2 对S E A 中均含有2 6k D a 的G S T 成分，导致二者检嚣率r S j 2 8 G S
7、 T 免疫缰盘清鳃检磁率较S E A 藕卤2 3 低，说孜高。若仅比较佐剂组和空白组血清的检测结果，3 种明r S j 2 8 G S T 免疫可能对抗S j 3 2 抗体的产生有一定的玩原并无显著性差异。说明r s i 3 2 在动物血吸虫病诊拮抗性。该拮抗性的进一步证实及其对血吸虫疫苗研蘩方瑟圈样具有应用前景。今后可通道联合应用r S j 3 2究有何影响，还有待迸一步磷究。硼r S j 2 3 以提高检出率，并可尝试应用这2 种抗原研g S 寻找高反应原性及寓特异性的华支睾吸虫的诊断抗原基因，利用基因重组技术对理想抗原基因进行体外重组与高效表达，基于高反应原性及高特异性基嚣的重组抗原，建
8、立快速、特异、敏感的免疫学诊断方法，目前该方甄的研究已成为华支睾吸虫病研究的一个热点和焦点。本研究通过构建华支睾吸虫成虫e D N A 表达文库，利用免疫学方法进一步筛选有效抗原基因是寻找与大量制备华支睾吸虫有效诊断与疫蓄抗原的最佳途径之。1 材料与方法1 1 材辩与试制来自我国东j 艺疫区( 镇赉县) 家犬体内分离华支睾吸虫成虫。大肠埃希菌X L l 一B l u e 、) ( 1 D 璩宿主菌及辅助噬菌体E x a s s i s t T M 为美国S t r a t a g e n e 公司产品。T r i z o lR e a g e n t 为I n v i t r o g e n
9、公司出品，k Z A PE x p r e s se D N A 合成试剂盒、k Z A PE x p r e s s 包装试剂盒及m R N A 分离纯化试剂盒均购盘S t r a t a g e n e 公司；C H R O M AS P I N - 4 0 0 柱及其他试剂均购自P r o m i g a 公司。硝酸纤维素滤膜( H y b o n d CE x t r a ) 为英国A m e r s h a m 公司产品；羊抗人碱性磷酸酶标记二抗为S i g m a 公司产品。 1 2 昝支睾吸虫成虫e D N A 表迭文库螗热建明1 2 1 疫区华支睾吸虫成虫的救集感染家犬体内取出
10、新鲜肝脏，和用机械方法破坏肝脏周边组织，采用注射器将生理盐水从大胆管注入，反复灌洗使虫体从肝脏周边破损的小胆管口流出，收集活体华支睾吸虫成 虫约2g ，用1m I J L 灭菌D E P C 水洗净并立即加入适量的T r i z o lR e a g e n t 冰水上研磨1 5r a i n ，分装lm 1 管，液氮保存。1 2 2 总R N A 的提取根据I n v i t r o g e n 公司的T r i z o lR e a g e n t 操作说明书进行，测D 撼r D 鳓。及D 期D 撕。，确定所分离R N A 的纯度，并计算得量。l Og LT A E 琼冕簧糖凝胶鬯泳检测R
11、 N A 提取结果。1 2 3m R N A 的分离利用分离纯化试剂盒分离纯化m R N A ，具体方法按S t r a t a g e n e 公司试剂盒说明书操作。1 2 4e D N A 的合成以m R N A 为模板，含X h oI 位点的O l i g o ( a T ) 1 8 为引物，在M M L V R T 反转录酶的 作用下合成第l 链e D N A ；加入大肠埃希氏菌R N a s e H 、大肠埃希氏菌D N A 聚合酶I 的作用下，合成第2 链e D N A ；加T 4D N A 聚合酶补平末端后与E c o RI 接头连接，经X h oI 酶切后得到5 端是E c o
12、 RI ，3 端是X h ol 酶切位点的双粘性末端e D N A 。1 2 5e D N A 的纯代将d s c D N A 经C H R O 麓AS P I N 一4 0 0 柱离心层析，除去已消化的接头碎片和长度小予8 6 4 0 0b p 的c D N A 分子。1 2 。6e D N A 与载体) , Z A P 的连接与包装将e 融 与载体在1 2 过夜连接，2 2 。C 包装2h 后。加大0m L S M 缓冲液和3 0 皿氯仿，混匀后高速离心3 08 水相移至新管，获得包装后的原始e D N A 文库。1 2 。7 原始文库库容量及重组率的测定取包装后原始c D N A 文库5
13、 转L ，按1 0 - 1 、1 0 “ 2 x l 、l 作梯度 释后各取l O 皿与3 5 0 秘LX L l 一B l u e 菌( D 6 0 0 r 瑚 O 5 ) 混匀3 7 孵育1 5m i n ，铺于含x 一班及I T P G (度) 的N Z Y 琼脂平板( 1 2 c m 童径) ，测定文库容量和组率。同对随机挑取1 0 0 个隧菌斑，浸于5 0 0 儿S缓 孛液中4 过夜。进一步采用P C R 方法鉴定重组 及插入c D N A 片段大小；总反应体积为2 5 曲，其中 有灭菌水1 2 皿，1 0 x P C Rb u f f e r5 灿，BP r i m e r1 心T
14、 7P r i m e r1 乩，噬菌体洗脱物1t r L ，d N T P s4 此，T tD N A 聚合酶1 拉k 反应条件为：9 4 0 C1m i n ，5 d l 戚7 2 0 C1 5r a i n ，3 0 个循环；7 2 弋1 0m i n 。用l Og 龙璩j糖凝胶电泳检测插入片段大小。1 2 8e D N A 文库的扩增及保存文库容量测定按每平板5 1 0 个噬菌斑将剩余的文库全部铺稷增。扩增后每板各加1 0m LS M 缓冲液，在摇床上洗噬菌斑并收集文摩，加入氯仿至终浓度为5 ，混室温孵育1 5m i n 后，以5 0 0 x g 转速离心除去菌锩片，收集上清；取5 皿
15、作梯度稀释，铺平板测扩增 文库滴度，其余上清一部分加入氯仿至终浓度O 。3 ，放4 。C 储存；另一部分加入D M S O 至终浓度7 ，一8 0 。C 保存。1 3 辈支睾嚷虫蔑虫e D N A 表迭文库撼筛选刚1 3 1 抗体探针的收集与纯化对实验室保存的疫5 0 0 份病人血清进行效价测定，用华支睾吸虫成虫囊蚴的虫体可溶性抗原与排泄分泌物抗原( 即E S 原) 的复合抗原，通过E L I S A 方法检测其抗体效价，效价高的病人血清作为免疫筛选的抗体探针。通过筛选法吸附去除血清中非特异性抗体成分：鄹将e o l iX L l 一B l u e 细胞与菲重组囱连磁A P 噬菌体鼗铺板，4
16、2 培养过夜获半融合裂解菌苔，将经m m o l LI P T G 浸泡并晾于的硝酸纤维素滤膜铺于平进行转膜，3 7 培养1 0h 左右，再将滤膜觏转镇誓培养的非重组k Z A P 噬菌体菌苔上。3 7 继续摇1 0h 左右。冷却取下滤膜并迅速浸予孙盯缓冲液漂洗1 - 2 次，将滤膜转移至封闭液中，室温封闭2将待吸附抗体探针用封闭渡作1 ：1 0 倍稀释后与潞共网温育6h ，吸附蜃的抗体探针加入0 0 5 叠爨4 保存备用或一2 0 长期保存。j i 反应原性抗原基因的筛选利用免疫学技术 匕好的抗体探针对我们构建的华支睾吸虫成虫及的c D N A 文库进行免疫学筛选，以获得高反应原寡基因。即以扩增库滴度1 6 x 1 0 6p f u l ( 原库窑1
