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1、石河子大学硕士学位论文哈萨克族原发性高血压患者血浆NO、HS水平及相关性研究姓名：翟志红申请学位级别：硕士专业：内科学指导教师：王忠20100601I摘 要 目的目的：比较新疆哈萨克族、汉族原发性高血压（EH）患者血浆一氧化氮（NO）、硫化氢（H2S）水平并分析其与血压、胰岛素抵抗、肥胖度、血脂、血尿酸等的关系。 方法：方法：选取2008年9月-10月流行病学调查的新疆玛纳斯县哈萨克族133例及同时期在我院体检的汉族130人为研究对象，根据血压水平，分为哈、汉EH组，哈、汉对照组，测量血压、身高、体重、腰围（WC）及臀围，取空腹静脉血5ml，测定血浆H2S、NO、胰岛素（FINS）、血糖（FP
2、G）、血尿酸、血脂等。计算体重指数（BMI）、腰臀比（WHR） 、体内脂肪百分比（BF%） 、胰岛素抵抗指数（IRI）等并进行比较。 结果结果： 哈、汉 EH 组血浆 H2S、NO 水平显著低于相应对照组（P0.05） ；哈、汉 EH 组血浆 BUA 水平显著高于相应对照组（P0.05);The BUA level in EH group of Kazakh and Han was higher than that in control group of Kazakh and Han.In the EH group of Kazakh, the plasma H2S level was neg
3、atively correlated with SBP、WC、BMI、WHR、FINS、IRI、BUA、TG（P 0.05)，见表 1。 1.3 纳入及排除标准 EH 诊断符合 2005 年中国高血压防治指南19的高血压诊断标准： 收缩压140mmHg和（或）舒张压90mmHg。EH 患者实验前 2 周未服用任何降压药，并维持饮食的相对稳定。排除继发性高血压、严重肝肾功能不全、糖尿病、脑卒中、恶性肿瘤、急性冠脉综合征、甲状腺疾病、心功能不全、妊娠、哺乳期妇女等。 2 主要实验仪器 电热恒温水温箱（HH.W210，上海医疗器械厂） 721 型分光光度计 (上海第三分析仪器厂) 低温高速离心机（S
4、IGMA 公司，德国） 低温离心机 （3.0Rs 型，中国北京医用离心机厂） 5ml 烧杯 2 个，50ml 烧杯 1 个（中国） 100l、200l、500l 微量加样器及吸头若干（中国） 试管架、冻存盒若干（中国） 电子天平（BS210S，瑞典） 搅拌器（JB-1A，上海精科.雷磁） 离子计（PXS-270， 上海精科.雷磁） 80超低温冰箱（SANYO，日本） 哈萨克族原发性高血压患者血浆 NO、H2S 水平及相关性研究 5 20冰箱（海尔，中国） 漩涡混合器（WH-861，江苏太仓市科教器材厂） 血生化自动分析仪（日立 7170S，日本） 3 试剂与方法 3.1 主要试剂 3.1.1
5、硫化氢测定所需试剂 去离子水 NaOH Na2S9H2 O EDTA（乙二胺四乙酸) 抗坏血酸 3.1.2 一氧化氮测定所需试剂 一氧化氮试剂盒由南京建成生物工程公司提供，包括： 试剂一：液体6ml2瓶，-20下保存3个月。用前放37水浴或温室使溶解后再用。 试剂二：液体6ml2瓶，-20下保存3个月。用前放37水浴或温室使溶解后再用。 试剂三：液体12ml1瓶，室温保存6个月。 试剂四：液体6ml1瓶，室温保存6个月。 试剂五：粉剂1支，用时加90-100热双蒸馏水20ml，充分溶解避光保存。 错误！未找到引用源。错误！未找到引用源。 试剂六：粉剂1支，用时加双蒸馏水8ml，避光冷藏保存，当
6、颜色变深咖啡色不可再用。 试剂七：液体8ml1瓶，室温保存6个月。 错误！未找到引用源。错误！未找到引用源。 10mmol/L，标准品0.51支，-20以下保存6个月。 3.2 方法 3.2.1 实验资料的收集、检测方法及质量控制 在研究对象知情并同意下，采用问卷形式收集研究对象的一般资料，包括性别、民族、年龄、个人史、既往史、 家族史及服药史等。 血压的测量：按照美国心脏联合会(AHA)推荐的测量方法。被测量者至少休息10 分钟，取坐位。裸露出右上臂，手掌向上平伸，肘部置于与心脏处于同一水平。将大小合适的袖带紧贴缚于被测量者上臂，袖带下缘在肘弯上约 2.5cm，将听诊器胸件置于肘窝肱动脉处，
7、匀速充气，使气囊压力达到桡动脉波动消失，再加压 30mmHg，然后以恒定速度(每秒 26mmHg)缓慢放气。 读取 Krotkoff 第时相与第时相时水银柱凸面的垂直高度，第时相柯氏音为收缩压（SBP） ，第时相柯氏音为舒张压(DBP)。血压单位为 mmHg。连续测量 3 次血压，每次间隔不少于 3 分钟，取 3 次测量值的平均值为个体血压。 哈萨克族原发性高血压患者血浆 NO、H2S 水平及相关性研究 6 身高、体重、腰围、臀围的测量。按中国肥胖问题工作组 2003 年指定的中国成人超重和肥胖症预防与控制指南（试用） 标准，测量具体要求20如下：受试者均要求空腹、脱鞋、穿轻薄的衣服，称量体重
8、用经过校正的医用体重秤，读数准确到 10 克。测量身高的量尺最小刻度为 1 毫米，量尺与地面垂直固定，受试者直立、两脚跟并拢靠近量尺，并将两肩及臀部也贴近量尺，读数精确到 1mm。腰围的测量让受试者直立，两脚分开 30-40cm，用没有弹性、最小刻度为 1mm 的软尺放在右侧腋中线胯骨上缘与第 12 肋骨下缘连线的中点（腰部的天然最狭窄部位） ，沿水平方向围绕腹部一周，紧贴而不压迫皮肤，在正常呼气末测量腰围的长度，读数准确至 1mm。臀围是测量臀部的最大周径，取两侧股骨粗隆水平面周径。 相关指标的计算：BMI体重(kg)/身高(m) 2，腰臀比(WHR) =WC/臀围。男性体 内脂肪百分数(B
9、F%) = 1.2BMI+0.23年龄16.2；女性(BF %) = 1.2BMI+0.23年龄5.4；胰岛素抵抗指数（IRI） ：按 HOMA 模型计算，IRI=（FINSFPG）/22.5 生化指标的检测：用日立 7170S 生化自动分析仪 测定 TC、TG、FPG、LDL-C、 HDL-C、BUA 等。FINS 用电化学发光发测定（在我院由检验科测定） 。 3.2.2 质量控制 调查人员需经过严格培训，所有培训工作均按照高血压流行病学调查操作指南进行。内容包括问卷调查的方法、人体测量的方法、血样的采集、标记、记录、分离、保存、调查表审核、资料录入等，由专人负责，均配有哈萨克族翻译。 测量
10、血压前半小时所有受试者均禁止饮酒、喝茶、吸烟等；血压测量采用台式 水银柱血压计；由经过培训的人员进行高血压的测量，连续测量 3 次，每次相隔不少于3 分钟，取 3 次平均值。 所有测量仪器在使用前全部经过校正； 所有生化指标的检测均在石河子大学医学院第一附属医院（三级甲等医院）检 验科进行。该科室设备精良，由专业人员进行检测，最大程度地减少检验的误差； 数据资料录入采用两人双边录入计算机，经核对无误后进行统计学分析。 3.2.3 血标本采集及处理 所有研究对象均采取空腹肘窝静脉全血 5ml，2 小时内离心分离血浆并分装为 2 部分，一部分检测生化各指标及胰岛素，另一部分低温-70保存备用，采血
11、器材均为一次性真空采血设备。 3.2.4 血浆H2S的测定 采用敏感硫电极测定法。实验原理：体液内H2S主要有两种形式存在，即物理溶解的H2S气体(约占1/3)及化学形式存在的HS-(约占2/3)21，其化学特性呈弱酸性，在强酸条件下，HS-与H+结合生成H 2S(公式1-1)，从体液中挥发，但物理溶解部分则不能析出； 在强碱条件下，H2S和HS-与OH-结合形成比较稳定的S2-(公式1-2、1-3)，采用敏感硫电极哈萨克族原发性高血压患者血浆 NO、H2S 水平及相关性研究 7可以精确测量溶液中S2-的浓度， 利用这一原理， 我们采用敏感硫电极， 测定血浆中的S2-，间接反映血浆H2S的浓度
12、。 HS-+H+=H 2S (公式1-1) 2HS-+2OH-=S2-+2H 2O (公式1-2) 2H2S+2OH-=S2-+2H 2O (公式1-3) 具体步骤如下： 抗氧化液的配制：NaOH8g，EDTA7g加去离子水85mL，配制成存储液，临使用前加入抗坏血酸10g，即抗氧化液。 标准硫离子溶液配制：Na2S9H2O 24.018g加去离子水至 100mL，配制成 1 mol/L标准溶液，再加入等量抗氧化液，密闭，-20冻存。 测定程序：电极在每次使用前须在去离子水中活化 2h 以上。打开离子计电源， 将测定项调至毫伏档，斜率调至 100%。取血浆 0.5ml 加同量抗氧化液于一 5m
13、l 烧杯中，用搅拌器充分混匀，将敏感硫电极与参比电极一起浸入到样品中，待读数稳定后纪录数据，用去离子水冲洗电极，每测一个样品结束，电极必须浸入去离子水中以保持其活化状态。每次测定前均应使用标准 S2-溶液用抗氧化液稀释成 1，10，20，40 及 80mol/L溶液做标准曲线。 标准曲线的建立 S2-浓度在1100mol/L浓度值与电极所测电压值呈明显指数相关性(图1)，所得方程为y=-62.723Ln(x)349.69，R2=0.9949。 mol/L 图 1 敏感硫电极所测 H2S 标准曲线 3.2.5 血浆 NO 的测定 采用硝酸还原酶测定法。实验原理：NO 化学性质活泼，半衰期极短，迅
14、速与分子氧化反应生成 NO2-和 NO 3-，故以血浆 NO 2-和 NO 3-之和检测 NO 的相对含量。应用南京建成生哈萨克族原发性高血压患者血浆 NO、H2S 水平及相关性研究 8物工程公司提供的 NO 试剂盒，采用硝酸还原酶特异性的将 NO3-还原为 NO 2-，NO 2-与显色剂亚乙烯二胺作用，生成粉红色偶氮化合物，通过比色测定出 NO2-和 NO 3-的含量。 具体步骤如下： 混合试剂的配制：按试剂1#：2#=1：1配制，用多少配多少，配好后充分混合待用，现用现配24小时内有效。 显色剂的配制：需多少配多少，试剂5#：6#：7#=2.5：1：1。剩余的显色剂置于盛双蒸水的40ml方
15、瓶中，避光保存。若结晶，放100水浴，反复摇动溶解后使用。 100mol/L 标准应用液的配制：取 0.1ml 标准品用双蒸水定容稀释至 10ml（即100 倍稀释） ，混匀，即为 100mol/L 标准应用液，现配现用。 操作表如下： 空白管 标准管 测定管 双蒸水（ml） 0.1 100mol/L 标准应用液（ml） 0.1 样本（ml） 0.1 混合试剂（ml） 0.4 0.4 0.4 混匀，37标准水浴 60 分钟 3#试剂（ml） 0.2 0.2 0.2 4#试剂（ml） 0.1 0.1 0.1 充分漩涡混匀 30 秒，室温静置 40 分钟，4000 转/分离心 10 分钟，取上清液 上清液（ml） 0.5 0.5 0.5 显色剂（ml） 0.6 0.6 0.6 混匀，室温静置 10 分钟，分光光度计蒸馏水调零,550nm，0.5cm 光径，测各管吸光度值 计算公式： N O 含量（mol/L）=（测定管吸光度-空白管吸光度）标准品浓度（100mol/L）样品测试前稀释倍数/（标准管吸光度空白管吸光度） 。 3.2.6 统计学分析 数据应用 SPSS16.0 统计软件处理，实验数据用均值士标准差(xs)表示，多组间比较用方差分析(F 检验)， 多因素采用 Pearson 相关及多元逐步回归分析。 结果以P0.05为差异有统计学意
